eng
Выпуск #4/2023
П. Е. Тимченко, Е. В. Тимченко, Д. А. Долгушкин, О. О. Фролов, А. Н. Николаенко, Л. Т. Волова, А. Ю. Ионов
Особенности cпектральной оценки поверхности титановых имплантов для животных Conferences, exhibitions, seminars
Особенности cпектральной оценки поверхности титановых имплантов для животных Conferences, exhibitions, seminars
Просмотры: 1073
DOI: 10.22184/1993-7296.FRos.2023.17.4.326.336
В работе представлены результаты исследования состояния материалаимплантатов, выполненных из титанового сплава ипокрытыххитозаном. Имплантаты были исследованы до и после доклинического применения на животных. Особенностью метода исследования является использование спектроскопии комбинационного рассеяния, обладающей высокой чувствительностью в области 400–1 800 см−1. Подтверждение результатов исследований поверхности имплантатов получено с помощью растровой электронной микроскопии. Данные по спектральным изменениям приняты в качестве косвеннойоценки полной биодеградации покрытия импланта через один месяц.
В работе представлены результаты исследования состояния материалаимплантатов, выполненных из титанового сплава ипокрытыххитозаном. Имплантаты были исследованы до и после доклинического применения на животных. Особенностью метода исследования является использование спектроскопии комбинационного рассеяния, обладающей высокой чувствительностью в области 400–1 800 см−1. Подтверждение результатов исследований поверхности имплантатов получено с помощью растровой электронной микроскопии. Данные по спектральным изменениям приняты в качестве косвеннойоценки полной биодеградации покрытия импланта через один месяц.
Теги: chitosan gaussian function deconvolution implant lda analysis lda-анализ raman scattering spectroscopy spectrum statistical analysis деконволюция функции гаусса имплант спектр спектроскопия рамановская статистический анализ хитозан
Особенности спектральной оценки поверхности титановых имплантов для животных
П. Е. Тимченко1, Е. В. Тимченко1, Д. А. Долгушкин2, О. О. Фролов1, А. Н. Николаенко2, Л. Т. Волова 2, А. Ю. Ионов1
Самарский национальный исследовательский университет им. ак. С. П. Королёва, Самара, Россия
Самарский государственный медицинский университет, институт экспериментальной медицины и биотехнологий, Самара, Россия
В работе представлены результаты исследования состояния материалаимплантатов, выполненных из титанового сплава ипокрытыххитозаном. Имплантаты были исследованы до и после доклинического применения на животных. Особенностью метода исследования является использование спектроскопии комбинационного рассеяния, обладающей высокой чувствительностью в области 400–1 800 см−1. Подтверждение результатов исследований поверхности имплантатов получено с помощью растровой электронной микроскопии. Данные по спектральным изменениям приняты в качестве косвеннойоценки полной биодеградации покрытия импланта через один месяц.
Ключевые слова: спектроскопия рамановская, деконволюция функции Гаусса, спектр, статистический анализ, хитозан, имплант, LDA-анализ
Статья получена: 27.01.2023
Статья принята: 27.02.2023
Введение
Оптические методы исследований нашли широкое распространение в биомедицинских задачах [1, 2].Среди оптических методов можно выделить ИК-спектроскопию, а также метод спектроскопии комбинационного рассеяния, который является неивазинвым и оперативным методом анализа [3]. ИК-спектроскопия [4] – хорошо зарекомендовавший себя метод, но работающий на пропускание с оценкой поглощения, что неприменимо для непрозрачных биообъектов.
Другойперспективный метод анализа элементного состава поверхности -растровая электронная микроскопия. Данный метод позволяет анализировать поверхность и элементный состав образца [5].
Метод спектроскопии комбинационного рассеяния в совокупности с математическими методами анализа и растровой электронной микроскопии может быть применен втехнологии созданиякомбинированных продуктов для тканевой инженерии, трансплантологии, реконструктивной хирургии.
В ряде случаев для достижения клинического результата необходимо либо ограничить контактматериал импланта со средой макроорганизма, либо напротив, нанести на него биоактивное покрытие. Такое покрытие импланта, может создать благоприятные условия для течения постимплантационного периода, стимулировать регенеративные процессы, предупреждать развитие воспалительных осложнений.
Актуальной задачей является исследование в динамике покрытий имплантатов на основе хитозана, так как он обладает биологической активностью, а также способностью активировать регенеративные процессы в тканях [6–13].В исследовании помогает комплексирование методов спектроскопии комбинационного рассеяния и растровой электронной микроскопии [14–16].
Поэтому, целью исследований стала разработка косвеннойоценки полной биодеградации покрытия титановых имплантов по результатам спектральных исследований их поверхности в экспериментах на животных.
Материал и методы
Доклинические экспериментальные исследования на животных выполнялись в биотехнологическом центре «БиоТех» ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России. 20 лабораторным половозрелым крысам стокаWistar имплантировали в лопатки образцы титана ВТ6 с покрытием хитозаномв обе лопатки. Сроками для выведения животных из эксперимента считались 1 месяц и 1 неделя после операции. Соответственно, первую операцию на одной лопатке животному выполняли за 1 месяц до забоя, а вторую операцию на другой лопатке за 1 неделю до забоя. Образцы на основе титана ВТ6 были изготовлены по технологии селективного лазерного спекания (Первый СПбГМУ им. ак. И. П. Павлова). Покрытие, содержащее хитозан, было нанесено на цилиндрические бруски для размещения их в области ости лопатки крысы.Предварительно с помощью цилиндрического зубоврачебного бора было сформировано сквозное отверстие в кости. Форма и размеры бруска позволяли жёстко и неподвижно разместить его в сформированном костном окне. Хитозан обладает антисептическими свойствами и способен участвовать в регенеративных процессах в периимплантарной зоне. Также покрытие может служить временной отграничивающей плёнкой для более глубокого покрытия импланта, эффект которого нам необходим в периимплантарной зоне в поздний временной период.Покрытие, содержащее хитозан, было нанесено на образцы на кафедре физики полимеров и кристаллов МГУ им. М. В. Ломоносова.
Нанесение покрытия на цилиндрические бруски из титанового сплава ВТ6 под давлением происходило при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 2 суток. Перед началом выполнения доклинических исследований образцы подвергали этапной стерилизации (рис. 1).
До начала выполнения экспериментального исследования поверхность образцов оценивали с помощью растрового сканирующего микроскопа JED–2300 (TokyoBoeki, Япония) с программным обеспечением AnalysisStation 3.63.01, напыление проводили с помощью прибора EMITECHK450X. Также выполняли исследование поверхности образцов до имплантации с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния.
В экспериментальном исследовании цилиндрические бруски из титанового сплава ВТ6 с покрытием хитозаном имплантировали крысам в ость лопатки, формируя в ней бором отверстие для плотного рамещения импланта в костной ткани (рис. 2). Раны послойно ушивали. Наблюдали животных в динамике, выводя их из эксперимента через 1 неделю и 1 месяц.
Извлеченные образцы после соответствующей обработки повторно исследовали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния. Метод был реализован с помощью стенда. Он включал в себя полупроводниковый лазер (LML‑785.0RB‑04), оптический модуль комбинационного рассеяния (PBL 785), спектрограф (Sharmrock SR‑303i) с интегрированной цифровой камерой (ANDOR DV‑420A-OE), охлаждаемой до −60 °C, и компьютер [17].
Спектрограф обеспечивал разрешение 0,15 нм по длинам волн при низком уровне собственных шумов. Мощность излучения лазера 200 мВт в пределах используемых времен экспозиции (30 сек) не вызывает изменений образцов, приводящих к изменению спектра.
Регистрацию КР-спектров проводили с помощью оптического зонда, который располагали над объектом на расстоянии 7 мм [18]. В данной работе анализ КР-спектров проводили в диапазоне 400–1 800 см−1, где наблюдаются основные линии различных органических соединений.Для исключения вклада автофлуоресценции в КР-спектр использовали метод вычитания флуоресцентной составляющей полиномиальной аппроксимации с дополнительной фильтрацией случайных шумовых эффектов. Обработку и анализ КР-спектров проводили в программном комплексе WolframMathematica 12.2.
При математической обработке результатовизмерений с помощью КР-спектроскопии использовали метод деконволюции функции Гаусса, а также с метод логистической регрессии и статистического анализа (LDA).
Результаты и обсуждение
При визуальном осмотре цилиндрические бруски из титанового сплаваВТ6 с покрытием на основе хитозанаможно отметить, что основания их в зоне распила неровные, имеют неоднородный рельеф. Образец покрыт белесоватой пленкой, местами отслаивающейся (рис. 3).При исследовании образцов при увеличениях 1 000–2 000 было обнаружено, что покрытие было представлено двумя разными типами участков (рис. 4).
Большую площадь образца (не менее 3 / 4) занимали участки покрытия, представленные белесоватыми зернистыми кристаллами разных размеров и форм. Они были плотно сцеплены друг с другом и поверхностью образца. Эти участки имели крайне неровный рельеф (рис. 5a).
Другой тип участков покрытия был более гладким, покрытым прозрачной пленкой, под которой также визуализировались зернистые белесоватые кристаллы (рис. 5b).
Необходимо отметить, что нами предварительно была выполнена растровая электронная микроскопия контрольных образцов титана ВТ6 до нанесения покрытия – ни пленок, ни белесоватых кристаллов на поверхности контрольных образцов обнаружено не было. Наличие таких неоднородных участков на образцах с покрытием, содержащим хитозан, возможно, обусловлено особенностью технологии нанесения порошка.
Стоит отметить, что участки покрытия, похожие на пленку, нередко отслаивались. На рис. 6 показан такой случай, при этом белесоватые кристаллы оставались фиксированными и к пленке, и к образцу под ней.
Спектроскопию комбинированного рассеяния образцов выполняли в динамике – до имплантации, а также через 1 неделю и 1 месяц после вывода животных из эксперимента. На рис. 7 представлены нормированные спектры КР исследуемых образцов. Видно, что образцы титана ВТ6, покрытые хитозаном, до имплантации имеют выраженные спектральные линии ~1 006 см−1 (Aromatic ring breathing of phenylalanine νs (C–C)), ~1 260 см−1 (Amide III – Due to C-Nstretching and N-H bending), ~1 414 см−1 (CH deformation), ~1 558 см−1 (Amide II Parallel / Antiparallel β-sheet structure), и ~1 748 см−1 (ν(C=O ester group), phospholipids (Lipid assignment)).
Однако после имплантации и последующего извлечения образцов при исследовании их поверхности на сроках 1 неделя и 1 месяц происходят спектральные изменения интенсивностей линий во всем исследуемом спектральном диапазоне.
Как видно из данного рисунка, интенсивность линии на 1 414 см−1 уменьшается, а также снижается интенсивность линий на 1 260 см−1, что может свидетельствовать о биодеградации хитозана уже спустя 1 неделю после имплантации.
Для повышения информативности полученных Рамановских спектров был проведен нелинейный регрессионный анализ спектров, состоящий в их разложении на спектральные линии. Полная область спектра 380–1 780 см−1 была поделена для анализа на 4 спектральных контура: 1 – 380 – 508 (adjR2 = 0,9999), 2 – 508 – 1136 (adjR2 = 0,9978), 3 – 1 136 – 1 491 (adjR2 = 0,9998), 4 – 1 491 – 1 781 см−1 (adjR2 = 0,9998).
Результаты, полученные после линейного дискриминантного анализа спектров, состоящие в их разложении на спектральные линии были использованы для дальнейшего анализа и визуализации результатов методом классификации методом логистической регрессии в пониженном (reduced) и LDA (рис. 8a, b).
Полученная дискриминационная модель позволяет классифицировать измеренные объекты с точностью 87,0%. Для оценки степени биодеградации покрытия титановых имплантов может быть использован комплексный критерий на основе относительной интенсивности 6 линий: 458 см−1, 497 см−1, 648 см−1, 728 см−1, 1 006 см−1, 1 414 см−1.
С помощью статистического анализа выделены линии КР-спектров, которые определяют основную разницу между исследуемыми группами. Установлено, что на линиях 1 414 см−1 (CH deformation) и 1 006 см−1 (Aromatic ring breathing of phenylalanine νs (C–C)) происходят наиболее значимые различия между группами до и спустя 1 месяц после имплантации.
Выводы
В результате исследований были получены следующие результаты. При исследовании цилиндрических брусков из титанового сплаваВТ6 с помощью растровой электронной микроскопии было установлено, что их поверхность имела два типа разнородных участков покрытия. Не менее 3 / 4 площади поверхности занимали участки, представленные белесоватыми зернистыми кристаллами разных размеров и форм, плотно сцепленные друг с другом и поверхностью образца. Другой тип участков покрытия был более гладким, покрытым прозрачной пленкой, под которой также визуализировались зернистые белесоватые кристаллы. Пленка нередко отслаивалась от импланта. Наличие разнородных участков покрытия мы связали с особенностью технологии нанесения хитозана на импланты.
С помощью метода спектроскопии комбинационного рассеяния было установлено, что исследуемые образцы, покрытые хитозаном, до имплантации имеют выраженные спектральные линии ~1 006 см−1 (Aromatic ring breathing of phenylalanine νs (C–C)), ~1 260 см−1 (AmideIII – DuetoC-NstretchingandN-Hbending), ~1 414 см−1 (CH deformation), ~1 558 см−1 (Amide II Parallel / Antiparallel β-sheetstructure), и ~1 748 см−1 (ν(C=Oestergroup), phospholipids (Lipid assignment)).
Выявлены спектральные изменения поверхностей исследуемых образцов в динамике после их имплантации в лопатку крысам. Показано, что интенсивность линий ~1 260 см−1 (AmideIII – DuetoC-N stretching and N-Hbending), ~1 414 см−1 (CH deformation) значительно снижались уже спустя 1 неделю после имплантации, что свидетельствовало о начале ранней биодеградации хитозана и, соответственно, ожидании проявлении его биологических эффектов.
87,0% перекрестно проверенных сгруппированных наблюдений классифицированы правильно. Для проверки значимости использовалась лямбда Уилкса, которая составила для всех двух дисриминантных функций 0,268. Хи-квадрат = 23,017, статистическая значимость = 0,000. Для оценки степени биодеградации покрытия титановых имплантов может быть использован комплексный критерий на основе относительной интенсивности 6 линий: 458 см−1, 497 см−1, 648 см−1, 728 см−1, 1 006 см−1, 1 414 см−1.
REFERENCES
Privalov V. E., SHemanin V. G. Lidarnoe uravnenie s uchetom konechnoj shiriny linii. Izvestiya RAN. 2015;79(2):170–180.
Привалов В. Е., Шеманин В. Г. Лидарное уравнение с учетом конечной ширины линии. Известия РАН. 2015;79(2):170–180.
Krafft C., Dietzek B., Popp J. Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues. Analyst. 2009;6(134):1046–1057
Ramakrishnaiah R., Rehman G., Basavarajappa S., Khuraif A., Durgesh B., Khan A., Rehman I. Applications of Raman spectroscopy in dentistry: Analysis of tooth structur. Appl. Spectrosc. Rev. 2015; 50(4):332–350.
Orunbaev A. Primenenie metodov IK-spektroskopii v medicine. Science and Education Scientific. 2021:2(4): 215–220.
Орунбаев A. Применение методов ИК-спектроскопии в медицине. Science and Education Scientific. 2021:2(4): 215–220.
Grigorenko V. B., Morozova L. V. Primenenie rastrovoj elektronnoj mikroskopii dlya izucheniya nachal’nyh stadij razrusheniya. Aviacionnye materialy i tekhnologii. 2018;1(50):77–87.
Григоренко В. Б., Морозова Л. В. Применение растровой электронной микроскопии для изучения начальных стадий разрушения. Авиационные материалы и технологии. 2018;1 (50):77–87.
Chouirfa H., Bouloussa H., Migonney V., Falentin-Daudré C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. ActaBiomater. 2019; 83: 37–54.
Guan B., Wang H., Xu R., Zheng G., Yang J., Liu Z., Cao M., Wu M., Song J., Li N., Li T., Cai Q., Yang X., Li Y., Zhang X. Establishing antibacterial multilayer films on the surface of direct metal laser sintered titanium primed with phase-transited lysozyme. Sci Rep. 2016, 6: 36408.
Privalov V. E., Shemanin V. G. Experimental Probing of Industrial Aerodisperse Flows. Scientific and Technical Bulletin of St. Petersburg Polytechnical University. Physics. Sciences. 2014, 206(4): 64–73.
Romanò C. L., Scarponi S., Gallazzi E., Romanò D., Drago L. Antibacterial coating of implants in orthopaedics and trauma: a classification proposal in an evolving panorama. J OrthopSurg Res. 2015;10:157.
Sánchez-Bodón J., Andrade Del Olmo J., Alonso J. M., Moreno-Benítez I., Vilas-Vilela J.L., Pérez-Álvarez L. Bioactive coatings on titanium: a review on hydroxylation, self-assembled monolayers (sams) and surface modification strategies. Polymers (Basel). 2021, 14(1):165.
Del Olmo J. A., Pérez-Álvarez L., Pacha-Olivenza M.Á., Ruiz-Rubio L., Gartziandia O., Vilas-Vilela J.L., Alonso J. M. Antibacterial catechol-based hyaluronic acid, chitosan and poly (N-vinyl pyrrolidone) coatings onto Ti6Al4V surfaces for application as biomedical implant. Int J BiolMacromol. 2021, 183:1222–1235.
Katan T., Kargl R., Mohan T., Steindorfer T., Mozetič M., Kovač J., StanaKleinschek K. Solid Phase Peptide Synthesis on Chitosan Thin Films. Biomacromolecules. 2022, 23(3): 731–742.
Lv H., Chen Z., Yang X., Cen L., Zhang X., Gao P. Layer-by-layer self-assembly of minocycline-loaded chitosan/alginate multilayer on titanium substrates to inhibit biofilm formation. J Dent. 2014, 42(11):1464–72.
Kumari S., Tiyyagura H. R., Pottathara Y. B., Sadasivuni K. K., Ponnamma D., Douglas T. E.L., Skirtach A. G., Mohan M. K. Surface functionalization of chitosan as a coating material for orthopaedic applications: A comprehensive review. Carbohydr Polym. 2021, 255:117487. doi: 10.1016/j.carbpol.2020.117487. PMID: 33436247.
Pellis A., Guebitz G. M., Nyanhongo G. S. Chitosan: sources, processing and modification techniques. Gels. 2022, 8(7):393. doi: 10.3390/gels8070393. PMID: 35877478; PMCID: PMC9322947.
Tian Y., Wu D., Wu D., Cui Y., Ren G., Wang Y., Wang J., Peng C Chitosan-based biomaterial scaffolds for the repair of infected bone defects. Front BioengBiotechnol. 2022, 10:899760. doi: 10.3389/fbioe.2022.899760. PMID: 35600891; PMCID: PMC9114740.
Timchenko E. V., Timchenko P. E., Pisareva E. V., Daniel M. A., Volova L. T., Fedotov A. A., Frolov O. O., Subatovich A. N. Optical analysis of bone tissue by Raman spectroscopy in experimental osteoporosis and its correction using allogeneic hydroxyapatite. Journal of Optical Technology. 2020, 87(3): 161–167.
Timchenko P. E., Timchenko E. V., Volova L. T., Zybin M. A., Frolov O. O., Dolgushov G. G. Optical Assessment of Dentin Materials. Optical Memory and Neural Networks. 2020, 29(4): 354–357.
Информация
о конфликте интересов
Конфликт интересов отсутствует.
П. Е. Тимченко1, Е. В. Тимченко1, Д. А. Долгушкин2, О. О. Фролов1, А. Н. Николаенко2, Л. Т. Волова 2, А. Ю. Ионов1
Самарский национальный исследовательский университет им. ак. С. П. Королёва, Самара, Россия
Самарский государственный медицинский университет, институт экспериментальной медицины и биотехнологий, Самара, Россия
В работе представлены результаты исследования состояния материалаимплантатов, выполненных из титанового сплава ипокрытыххитозаном. Имплантаты были исследованы до и после доклинического применения на животных. Особенностью метода исследования является использование спектроскопии комбинационного рассеяния, обладающей высокой чувствительностью в области 400–1 800 см−1. Подтверждение результатов исследований поверхности имплантатов получено с помощью растровой электронной микроскопии. Данные по спектральным изменениям приняты в качестве косвеннойоценки полной биодеградации покрытия импланта через один месяц.
Ключевые слова: спектроскопия рамановская, деконволюция функции Гаусса, спектр, статистический анализ, хитозан, имплант, LDA-анализ
Статья получена: 27.01.2023
Статья принята: 27.02.2023
Введение
Оптические методы исследований нашли широкое распространение в биомедицинских задачах [1, 2].Среди оптических методов можно выделить ИК-спектроскопию, а также метод спектроскопии комбинационного рассеяния, который является неивазинвым и оперативным методом анализа [3]. ИК-спектроскопия [4] – хорошо зарекомендовавший себя метод, но работающий на пропускание с оценкой поглощения, что неприменимо для непрозрачных биообъектов.
Другойперспективный метод анализа элементного состава поверхности -растровая электронная микроскопия. Данный метод позволяет анализировать поверхность и элементный состав образца [5].
Метод спектроскопии комбинационного рассеяния в совокупности с математическими методами анализа и растровой электронной микроскопии может быть применен втехнологии созданиякомбинированных продуктов для тканевой инженерии, трансплантологии, реконструктивной хирургии.
В ряде случаев для достижения клинического результата необходимо либо ограничить контактматериал импланта со средой макроорганизма, либо напротив, нанести на него биоактивное покрытие. Такое покрытие импланта, может создать благоприятные условия для течения постимплантационного периода, стимулировать регенеративные процессы, предупреждать развитие воспалительных осложнений.
Актуальной задачей является исследование в динамике покрытий имплантатов на основе хитозана, так как он обладает биологической активностью, а также способностью активировать регенеративные процессы в тканях [6–13].В исследовании помогает комплексирование методов спектроскопии комбинационного рассеяния и растровой электронной микроскопии [14–16].
Поэтому, целью исследований стала разработка косвеннойоценки полной биодеградации покрытия титановых имплантов по результатам спектральных исследований их поверхности в экспериментах на животных.
Материал и методы
Доклинические экспериментальные исследования на животных выполнялись в биотехнологическом центре «БиоТех» ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России. 20 лабораторным половозрелым крысам стокаWistar имплантировали в лопатки образцы титана ВТ6 с покрытием хитозаномв обе лопатки. Сроками для выведения животных из эксперимента считались 1 месяц и 1 неделя после операции. Соответственно, первую операцию на одной лопатке животному выполняли за 1 месяц до забоя, а вторую операцию на другой лопатке за 1 неделю до забоя. Образцы на основе титана ВТ6 были изготовлены по технологии селективного лазерного спекания (Первый СПбГМУ им. ак. И. П. Павлова). Покрытие, содержащее хитозан, было нанесено на цилиндрические бруски для размещения их в области ости лопатки крысы.Предварительно с помощью цилиндрического зубоврачебного бора было сформировано сквозное отверстие в кости. Форма и размеры бруска позволяли жёстко и неподвижно разместить его в сформированном костном окне. Хитозан обладает антисептическими свойствами и способен участвовать в регенеративных процессах в периимплантарной зоне. Также покрытие может служить временной отграничивающей плёнкой для более глубокого покрытия импланта, эффект которого нам необходим в периимплантарной зоне в поздний временной период.Покрытие, содержащее хитозан, было нанесено на образцы на кафедре физики полимеров и кристаллов МГУ им. М. В. Ломоносова.
Нанесение покрытия на цилиндрические бруски из титанового сплава ВТ6 под давлением происходило при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 2 суток. Перед началом выполнения доклинических исследований образцы подвергали этапной стерилизации (рис. 1).
До начала выполнения экспериментального исследования поверхность образцов оценивали с помощью растрового сканирующего микроскопа JED–2300 (TokyoBoeki, Япония) с программным обеспечением AnalysisStation 3.63.01, напыление проводили с помощью прибора EMITECHK450X. Также выполняли исследование поверхности образцов до имплантации с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния.
В экспериментальном исследовании цилиндрические бруски из титанового сплава ВТ6 с покрытием хитозаном имплантировали крысам в ость лопатки, формируя в ней бором отверстие для плотного рамещения импланта в костной ткани (рис. 2). Раны послойно ушивали. Наблюдали животных в динамике, выводя их из эксперимента через 1 неделю и 1 месяц.
Извлеченные образцы после соответствующей обработки повторно исследовали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния. Метод был реализован с помощью стенда. Он включал в себя полупроводниковый лазер (LML‑785.0RB‑04), оптический модуль комбинационного рассеяния (PBL 785), спектрограф (Sharmrock SR‑303i) с интегрированной цифровой камерой (ANDOR DV‑420A-OE), охлаждаемой до −60 °C, и компьютер [17].
Спектрограф обеспечивал разрешение 0,15 нм по длинам волн при низком уровне собственных шумов. Мощность излучения лазера 200 мВт в пределах используемых времен экспозиции (30 сек) не вызывает изменений образцов, приводящих к изменению спектра.
Регистрацию КР-спектров проводили с помощью оптического зонда, который располагали над объектом на расстоянии 7 мм [18]. В данной работе анализ КР-спектров проводили в диапазоне 400–1 800 см−1, где наблюдаются основные линии различных органических соединений.Для исключения вклада автофлуоресценции в КР-спектр использовали метод вычитания флуоресцентной составляющей полиномиальной аппроксимации с дополнительной фильтрацией случайных шумовых эффектов. Обработку и анализ КР-спектров проводили в программном комплексе WolframMathematica 12.2.
При математической обработке результатовизмерений с помощью КР-спектроскопии использовали метод деконволюции функции Гаусса, а также с метод логистической регрессии и статистического анализа (LDA).
Результаты и обсуждение
При визуальном осмотре цилиндрические бруски из титанового сплаваВТ6 с покрытием на основе хитозанаможно отметить, что основания их в зоне распила неровные, имеют неоднородный рельеф. Образец покрыт белесоватой пленкой, местами отслаивающейся (рис. 3).При исследовании образцов при увеличениях 1 000–2 000 было обнаружено, что покрытие было представлено двумя разными типами участков (рис. 4).
Большую площадь образца (не менее 3 / 4) занимали участки покрытия, представленные белесоватыми зернистыми кристаллами разных размеров и форм. Они были плотно сцеплены друг с другом и поверхностью образца. Эти участки имели крайне неровный рельеф (рис. 5a).
Другой тип участков покрытия был более гладким, покрытым прозрачной пленкой, под которой также визуализировались зернистые белесоватые кристаллы (рис. 5b).
Необходимо отметить, что нами предварительно была выполнена растровая электронная микроскопия контрольных образцов титана ВТ6 до нанесения покрытия – ни пленок, ни белесоватых кристаллов на поверхности контрольных образцов обнаружено не было. Наличие таких неоднородных участков на образцах с покрытием, содержащим хитозан, возможно, обусловлено особенностью технологии нанесения порошка.
Стоит отметить, что участки покрытия, похожие на пленку, нередко отслаивались. На рис. 6 показан такой случай, при этом белесоватые кристаллы оставались фиксированными и к пленке, и к образцу под ней.
Спектроскопию комбинированного рассеяния образцов выполняли в динамике – до имплантации, а также через 1 неделю и 1 месяц после вывода животных из эксперимента. На рис. 7 представлены нормированные спектры КР исследуемых образцов. Видно, что образцы титана ВТ6, покрытые хитозаном, до имплантации имеют выраженные спектральные линии ~1 006 см−1 (Aromatic ring breathing of phenylalanine νs (C–C)), ~1 260 см−1 (Amide III – Due to C-Nstretching and N-H bending), ~1 414 см−1 (CH deformation), ~1 558 см−1 (Amide II Parallel / Antiparallel β-sheet structure), и ~1 748 см−1 (ν(C=O ester group), phospholipids (Lipid assignment)).
Однако после имплантации и последующего извлечения образцов при исследовании их поверхности на сроках 1 неделя и 1 месяц происходят спектральные изменения интенсивностей линий во всем исследуемом спектральном диапазоне.
Как видно из данного рисунка, интенсивность линии на 1 414 см−1 уменьшается, а также снижается интенсивность линий на 1 260 см−1, что может свидетельствовать о биодеградации хитозана уже спустя 1 неделю после имплантации.
Для повышения информативности полученных Рамановских спектров был проведен нелинейный регрессионный анализ спектров, состоящий в их разложении на спектральные линии. Полная область спектра 380–1 780 см−1 была поделена для анализа на 4 спектральных контура: 1 – 380 – 508 (adjR2 = 0,9999), 2 – 508 – 1136 (adjR2 = 0,9978), 3 – 1 136 – 1 491 (adjR2 = 0,9998), 4 – 1 491 – 1 781 см−1 (adjR2 = 0,9998).
Результаты, полученные после линейного дискриминантного анализа спектров, состоящие в их разложении на спектральные линии были использованы для дальнейшего анализа и визуализации результатов методом классификации методом логистической регрессии в пониженном (reduced) и LDA (рис. 8a, b).
Полученная дискриминационная модель позволяет классифицировать измеренные объекты с точностью 87,0%. Для оценки степени биодеградации покрытия титановых имплантов может быть использован комплексный критерий на основе относительной интенсивности 6 линий: 458 см−1, 497 см−1, 648 см−1, 728 см−1, 1 006 см−1, 1 414 см−1.
С помощью статистического анализа выделены линии КР-спектров, которые определяют основную разницу между исследуемыми группами. Установлено, что на линиях 1 414 см−1 (CH deformation) и 1 006 см−1 (Aromatic ring breathing of phenylalanine νs (C–C)) происходят наиболее значимые различия между группами до и спустя 1 месяц после имплантации.
Выводы
В результате исследований были получены следующие результаты. При исследовании цилиндрических брусков из титанового сплаваВТ6 с помощью растровой электронной микроскопии было установлено, что их поверхность имела два типа разнородных участков покрытия. Не менее 3 / 4 площади поверхности занимали участки, представленные белесоватыми зернистыми кристаллами разных размеров и форм, плотно сцепленные друг с другом и поверхностью образца. Другой тип участков покрытия был более гладким, покрытым прозрачной пленкой, под которой также визуализировались зернистые белесоватые кристаллы. Пленка нередко отслаивалась от импланта. Наличие разнородных участков покрытия мы связали с особенностью технологии нанесения хитозана на импланты.
С помощью метода спектроскопии комбинационного рассеяния было установлено, что исследуемые образцы, покрытые хитозаном, до имплантации имеют выраженные спектральные линии ~1 006 см−1 (Aromatic ring breathing of phenylalanine νs (C–C)), ~1 260 см−1 (AmideIII – DuetoC-NstretchingandN-Hbending), ~1 414 см−1 (CH deformation), ~1 558 см−1 (Amide II Parallel / Antiparallel β-sheetstructure), и ~1 748 см−1 (ν(C=Oestergroup), phospholipids (Lipid assignment)).
Выявлены спектральные изменения поверхностей исследуемых образцов в динамике после их имплантации в лопатку крысам. Показано, что интенсивность линий ~1 260 см−1 (AmideIII – DuetoC-N stretching and N-Hbending), ~1 414 см−1 (CH deformation) значительно снижались уже спустя 1 неделю после имплантации, что свидетельствовало о начале ранней биодеградации хитозана и, соответственно, ожидании проявлении его биологических эффектов.
87,0% перекрестно проверенных сгруппированных наблюдений классифицированы правильно. Для проверки значимости использовалась лямбда Уилкса, которая составила для всех двух дисриминантных функций 0,268. Хи-квадрат = 23,017, статистическая значимость = 0,000. Для оценки степени биодеградации покрытия титановых имплантов может быть использован комплексный критерий на основе относительной интенсивности 6 линий: 458 см−1, 497 см−1, 648 см−1, 728 см−1, 1 006 см−1, 1 414 см−1.
REFERENCES
Privalov V. E., SHemanin V. G. Lidarnoe uravnenie s uchetom konechnoj shiriny linii. Izvestiya RAN. 2015;79(2):170–180.
Привалов В. Е., Шеманин В. Г. Лидарное уравнение с учетом конечной ширины линии. Известия РАН. 2015;79(2):170–180.
Krafft C., Dietzek B., Popp J. Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues. Analyst. 2009;6(134):1046–1057
Ramakrishnaiah R., Rehman G., Basavarajappa S., Khuraif A., Durgesh B., Khan A., Rehman I. Applications of Raman spectroscopy in dentistry: Analysis of tooth structur. Appl. Spectrosc. Rev. 2015; 50(4):332–350.
Orunbaev A. Primenenie metodov IK-spektroskopii v medicine. Science and Education Scientific. 2021:2(4): 215–220.
Орунбаев A. Применение методов ИК-спектроскопии в медицине. Science and Education Scientific. 2021:2(4): 215–220.
Grigorenko V. B., Morozova L. V. Primenenie rastrovoj elektronnoj mikroskopii dlya izucheniya nachal’nyh stadij razrusheniya. Aviacionnye materialy i tekhnologii. 2018;1(50):77–87.
Григоренко В. Б., Морозова Л. В. Применение растровой электронной микроскопии для изучения начальных стадий разрушения. Авиационные материалы и технологии. 2018;1 (50):77–87.
Chouirfa H., Bouloussa H., Migonney V., Falentin-Daudré C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. ActaBiomater. 2019; 83: 37–54.
Guan B., Wang H., Xu R., Zheng G., Yang J., Liu Z., Cao M., Wu M., Song J., Li N., Li T., Cai Q., Yang X., Li Y., Zhang X. Establishing antibacterial multilayer films on the surface of direct metal laser sintered titanium primed with phase-transited lysozyme. Sci Rep. 2016, 6: 36408.
Privalov V. E., Shemanin V. G. Experimental Probing of Industrial Aerodisperse Flows. Scientific and Technical Bulletin of St. Petersburg Polytechnical University. Physics. Sciences. 2014, 206(4): 64–73.
Romanò C. L., Scarponi S., Gallazzi E., Romanò D., Drago L. Antibacterial coating of implants in orthopaedics and trauma: a classification proposal in an evolving panorama. J OrthopSurg Res. 2015;10:157.
Sánchez-Bodón J., Andrade Del Olmo J., Alonso J. M., Moreno-Benítez I., Vilas-Vilela J.L., Pérez-Álvarez L. Bioactive coatings on titanium: a review on hydroxylation, self-assembled monolayers (sams) and surface modification strategies. Polymers (Basel). 2021, 14(1):165.
Del Olmo J. A., Pérez-Álvarez L., Pacha-Olivenza M.Á., Ruiz-Rubio L., Gartziandia O., Vilas-Vilela J.L., Alonso J. M. Antibacterial catechol-based hyaluronic acid, chitosan and poly (N-vinyl pyrrolidone) coatings onto Ti6Al4V surfaces for application as biomedical implant. Int J BiolMacromol. 2021, 183:1222–1235.
Katan T., Kargl R., Mohan T., Steindorfer T., Mozetič M., Kovač J., StanaKleinschek K. Solid Phase Peptide Synthesis on Chitosan Thin Films. Biomacromolecules. 2022, 23(3): 731–742.
Lv H., Chen Z., Yang X., Cen L., Zhang X., Gao P. Layer-by-layer self-assembly of minocycline-loaded chitosan/alginate multilayer on titanium substrates to inhibit biofilm formation. J Dent. 2014, 42(11):1464–72.
Kumari S., Tiyyagura H. R., Pottathara Y. B., Sadasivuni K. K., Ponnamma D., Douglas T. E.L., Skirtach A. G., Mohan M. K. Surface functionalization of chitosan as a coating material for orthopaedic applications: A comprehensive review. Carbohydr Polym. 2021, 255:117487. doi: 10.1016/j.carbpol.2020.117487. PMID: 33436247.
Pellis A., Guebitz G. M., Nyanhongo G. S. Chitosan: sources, processing and modification techniques. Gels. 2022, 8(7):393. doi: 10.3390/gels8070393. PMID: 35877478; PMCID: PMC9322947.
Tian Y., Wu D., Wu D., Cui Y., Ren G., Wang Y., Wang J., Peng C Chitosan-based biomaterial scaffolds for the repair of infected bone defects. Front BioengBiotechnol. 2022, 10:899760. doi: 10.3389/fbioe.2022.899760. PMID: 35600891; PMCID: PMC9114740.
Timchenko E. V., Timchenko P. E., Pisareva E. V., Daniel M. A., Volova L. T., Fedotov A. A., Frolov O. O., Subatovich A. N. Optical analysis of bone tissue by Raman spectroscopy in experimental osteoporosis and its correction using allogeneic hydroxyapatite. Journal of Optical Technology. 2020, 87(3): 161–167.
Timchenko P. E., Timchenko E. V., Volova L. T., Zybin M. A., Frolov O. O., Dolgushov G. G. Optical Assessment of Dentin Materials. Optical Memory and Neural Networks. 2020, 29(4): 354–357.
Информация
о конфликте интересов
Конфликт интересов отсутствует.
Отзывы читателей
