eng
Выпуск #7/2017
П.Прабхат, Н.Андерсен, Т.Эрдоган
Спектральная визуализация с использованием широко перестраиваемых тонкопленочных фильтров VersaChrome
Спектральная визуализация с использованием широко перестраиваемых тонкопленочных фильтров VersaChrome
Просмотры: 3133
В данной статье описан инновационный подход к спектральной визуализации с использованием перестраиваемых тонкопленочных фильтров, выпускаемых компанией Semrock.
DOI: 10.22184/1993-7296.2017.67.7.46.51
DOI: 10.22184/1993-7296.2017.67.7.46.51
Теги: spectral visualization tunable thin-film filters перестраиваемые тонкопленочные фильтры спектральная визуализация
ВВЕДЕНИЕ
Системы для спектральной визуализации обеспечивают гибкость в выборе длины волны. Очень удобно, если в экспериментах используются разные комбинации флуорофоров, так как пропадает необходимость смены фильтров. Однако, несмотря на имеющуюся возможность спектральной перестройки, стандартные системы визуализации редко проявляют те преимущества, которые дает использование тонкопленочных интерференционных фильтров, а именно: высокий коэффициент передачи в сочетании с крутыми краями на границе полосы пропускания и высокий коэффициент блокировки излучения вне полосы. В данной статье описан инновационный подход к спектральной визуализации с использованием перестраиваемых тонкопленочных фильтров, выпускаемых компанией Semrock.
ТЕХНОЛОГИЯ
В основе новой технологии спектральной визуализации [1–4] лежит метод использования перестраиваемых в широком диапазоне спектра тонкопленочных оптических фильтров серии VersaChrome [5], выпускаемых компанией Semrock. В отличие от стандартных тонкопленочных интерференционных фильтров с установленными спектральными характеристиками, спектральные характеристики фильтров VersaChrome меняются в зависимости от угла падения излучения, при этом форма спектра не претерпевает никаких заметных изменений.
На рис.1 представлены спектры фильтра серии VersaChrome от Semrock, TBP01-620/15, полученные при различных углах падения излучения на поверхность фильтра. Данный фильтр обладает гарантированной минимальной шириной полосы пропускания порядка 15 нм и шириной на полувысоте (FWHM) – 20 нм. Как видно (см. рис.1), фильтр не только сохраняет ширину полосы при больших значениях угла падения, но и обладает высоким коэффициентом пропускания, при этом крутые края спектра надежно отрезают излучение из области, расположенной вне полосы пропускания.
Центральная длина волны данного перестраиваемого фильтра (верно для всех фильтров VersaChrome) определяется следующим уравнением:
,
где neff – эффективный показатель преломления тонкопленочного покрытия.
Для данного фильтра neff составляет примерно 1,85. Подчеркнем, что спектр пропускания данного фильтра меняется непрерывно. Если диапазон перестройки составляет 12% от длины волны при нормальном угле падения (угол падения изменяется в диапазоне от 0 до 60°), то для покрытия всего видимого диапазона понадобится всего 4 фильтра.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Микроскопия
Изображения клеток эндотелия легочной артерии быка (BPAE cells) с флуоресцентными метками MitoTracker® red (митохондрия), Alexa Fluor® 568 (F-актин) и SYTOX® Orange (ядро) были получены с помощью микроскопа Olympus BX41, оснащенного камерой ORCA C8484 компании Hamamatsu (образец предоставлен Mike Davidson, Molecular Expressions™). В конструкцию микроскопа встроен модуль с перестраиваемым фильтром, сквозь который проходит флуоресцирующее излучение. Управление модулем осуществлялось с помощью компьютера. Принцип работы микроскопа представлен на рис.2.
Для одновременного возбуждения всех флуорофоров в образце в микроскопе в куб с набором фильтров устанавливается фильтр, пропускающий волну возбуждения (FF01-543/22-25) и дихроичный фильтр (FF562-Di02–25x36). В модуль с перестраиваемым фильтром был помещен перестраиваемый запирающий фильтр TBP01-620/15-25x36. Последовательность наблюдаемых изображений (lambda stack) регистрировали, меняя при этом с шагом 1° угол наклона фильтра (таким образом менялся угол падения излучения флуоресценции).
Линейное спектральное разделение (Linear unmixing)
Для спектрального разделения данных (linear unmixing [1–4]) значения интенсивностей регистрировались с помощью пикселов, составляющих матрицу приемника, и последовательность изображений представлялась в виде матриц. Далее использовался пакет MATLAB для решения системы линейных уравнений методом наименьших квадратов min || Ax – b ||2 при условии, что x ≥ 0, где x – разница спектральных вкладов каждого флуорофора в заданном пикселе. Матрица A содержит опорные спектры флуорофоров, соответствующие каждому из используемых (рис.4), матрица b состоит из значений интенсивности в заданном пикселе в серии изображений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В приведенных исследованиях спектральная визуализация с использованием перестраиваемых фильтров была продемонстрирована на примере конкретного образца. Была зарегистрирована серия изображений образца, помеченного флуорофорами MitoTracker® red, Alexa Fluor® 568 и SYTOX® Orange, с использованием перестраиваемого фильтра Semrock серии VersaChrome® (см. "Материалы и методы"). На рис.3 представлены изображения, зарегистрированные со спектральным шагом 5 нм.
Из анализа полученных изображений видно, что ядро, окрашенное SYTOX® Orange, можно легко выделить среди других компонентов клетки, используя только один перестраиваемый запирающий фильтр, который предназначен для визуализации всех флуорофоров. Однако F-актин и митохондрии помечены флуорофорами с сильно перекрывающимися спектрами (Alexa Fluor® 568 и MitoTracker®), поэтому для визуализации соответствующих компонентов было необходимо использовать разделение каналов эмиссии.
Выбранные из последовательности изображений участки, отображающие чистый спектральный вклад каждого флуорофора, представлены на рис.3. Нормированные значения интенсивности (после вычитания фонового сигнала), соответствующие каждому флуорофору, изображены на рис.4. Данные графики представляют собой эталонные спектры флуорофоров, используемые в алгоритме спектрального разделения. Затем изображения из зарегистрированной последовательности использовались вместе в алгоритме разделения спектральных данных (см."Материалы и методы") для спектрального разделения изображений всех флуорофоров (рис.5).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Фильтры серии VersaChrome® могут быть размещены на пути излучения, возбуждающего образец, и флуоресцентного излучения. По мере того как меняется угол падения на фильтр пучка излучения, можно регистрировать различные спектральные линии. Кроме того, следует отметить, что спектральные характеристики данных перестраиваемых фильтров практически одинаковы для s- и p-поляризованного света. Данную особенность довольно сложно получить при использовании жидкокристаллических и акустооптических перестраиваемых фильтров [2–5]. Нечувствительность к поляризации крайне желательна для спектральных систем визуализации, и кроме того, ограничения на поляризацию излучения для фильтров с токовым управлением могут привести к потере половины сигнала во многих сканирующих спектральных приборах. Использование фильтров VersaChrome® не приводит к таким потерям. Поэтому эти фильтры могут не только увеличить пропускную способность приборов спектральной визуализации, но и упростить конструкцию экспериментального прибора [5].
ЛИТЕРАТУРА
1. Visualization of Microscopy-Based Spectral Imaging Data from Multi-Label Tissue Sections, Mansfield JR, Hoyt C, Richard, RM, Current Protocols in Molecular Biology, 84:14.19.1–14.19.15 2008.
2. Spectral Imaging: Principles and Applications. Garini Y, Young IT, McNamara G., Cytometry A, 69(8):735–47, 2006.
3. Multispectral Imaging Fluorescence Microscopy for Living Cells, Hiraoka Y, Shimi T., and Haraguchi T. Cell Structure and Function, 27: 367–374, 2002.
4. Электронный ресурс: http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/
5. Semrock VersaChrome™ – the First Widely Tunable Thin-film Optical Filters, Erdogan T and Wang L. Электронный ресурс: http://semrock.com/, 2010.
Системы для спектральной визуализации обеспечивают гибкость в выборе длины волны. Очень удобно, если в экспериментах используются разные комбинации флуорофоров, так как пропадает необходимость смены фильтров. Однако, несмотря на имеющуюся возможность спектральной перестройки, стандартные системы визуализации редко проявляют те преимущества, которые дает использование тонкопленочных интерференционных фильтров, а именно: высокий коэффициент передачи в сочетании с крутыми краями на границе полосы пропускания и высокий коэффициент блокировки излучения вне полосы. В данной статье описан инновационный подход к спектральной визуализации с использованием перестраиваемых тонкопленочных фильтров, выпускаемых компанией Semrock.
ТЕХНОЛОГИЯ
В основе новой технологии спектральной визуализации [1–4] лежит метод использования перестраиваемых в широком диапазоне спектра тонкопленочных оптических фильтров серии VersaChrome [5], выпускаемых компанией Semrock. В отличие от стандартных тонкопленочных интерференционных фильтров с установленными спектральными характеристиками, спектральные характеристики фильтров VersaChrome меняются в зависимости от угла падения излучения, при этом форма спектра не претерпевает никаких заметных изменений.
На рис.1 представлены спектры фильтра серии VersaChrome от Semrock, TBP01-620/15, полученные при различных углах падения излучения на поверхность фильтра. Данный фильтр обладает гарантированной минимальной шириной полосы пропускания порядка 15 нм и шириной на полувысоте (FWHM) – 20 нм. Как видно (см. рис.1), фильтр не только сохраняет ширину полосы при больших значениях угла падения, но и обладает высоким коэффициентом пропускания, при этом крутые края спектра надежно отрезают излучение из области, расположенной вне полосы пропускания.
Центральная длина волны данного перестраиваемого фильтра (верно для всех фильтров VersaChrome) определяется следующим уравнением:
,
где neff – эффективный показатель преломления тонкопленочного покрытия.
Для данного фильтра neff составляет примерно 1,85. Подчеркнем, что спектр пропускания данного фильтра меняется непрерывно. Если диапазон перестройки составляет 12% от длины волны при нормальном угле падения (угол падения изменяется в диапазоне от 0 до 60°), то для покрытия всего видимого диапазона понадобится всего 4 фильтра.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Микроскопия
Изображения клеток эндотелия легочной артерии быка (BPAE cells) с флуоресцентными метками MitoTracker® red (митохондрия), Alexa Fluor® 568 (F-актин) и SYTOX® Orange (ядро) были получены с помощью микроскопа Olympus BX41, оснащенного камерой ORCA C8484 компании Hamamatsu (образец предоставлен Mike Davidson, Molecular Expressions™). В конструкцию микроскопа встроен модуль с перестраиваемым фильтром, сквозь который проходит флуоресцирующее излучение. Управление модулем осуществлялось с помощью компьютера. Принцип работы микроскопа представлен на рис.2.
Для одновременного возбуждения всех флуорофоров в образце в микроскопе в куб с набором фильтров устанавливается фильтр, пропускающий волну возбуждения (FF01-543/22-25) и дихроичный фильтр (FF562-Di02–25x36). В модуль с перестраиваемым фильтром был помещен перестраиваемый запирающий фильтр TBP01-620/15-25x36. Последовательность наблюдаемых изображений (lambda stack) регистрировали, меняя при этом с шагом 1° угол наклона фильтра (таким образом менялся угол падения излучения флуоресценции).
Линейное спектральное разделение (Linear unmixing)
Для спектрального разделения данных (linear unmixing [1–4]) значения интенсивностей регистрировались с помощью пикселов, составляющих матрицу приемника, и последовательность изображений представлялась в виде матриц. Далее использовался пакет MATLAB для решения системы линейных уравнений методом наименьших квадратов min || Ax – b ||2 при условии, что x ≥ 0, где x – разница спектральных вкладов каждого флуорофора в заданном пикселе. Матрица A содержит опорные спектры флуорофоров, соответствующие каждому из используемых (рис.4), матрица b состоит из значений интенсивности в заданном пикселе в серии изображений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В приведенных исследованиях спектральная визуализация с использованием перестраиваемых фильтров была продемонстрирована на примере конкретного образца. Была зарегистрирована серия изображений образца, помеченного флуорофорами MitoTracker® red, Alexa Fluor® 568 и SYTOX® Orange, с использованием перестраиваемого фильтра Semrock серии VersaChrome® (см. "Материалы и методы"). На рис.3 представлены изображения, зарегистрированные со спектральным шагом 5 нм.
Из анализа полученных изображений видно, что ядро, окрашенное SYTOX® Orange, можно легко выделить среди других компонентов клетки, используя только один перестраиваемый запирающий фильтр, который предназначен для визуализации всех флуорофоров. Однако F-актин и митохондрии помечены флуорофорами с сильно перекрывающимися спектрами (Alexa Fluor® 568 и MitoTracker®), поэтому для визуализации соответствующих компонентов было необходимо использовать разделение каналов эмиссии.
Выбранные из последовательности изображений участки, отображающие чистый спектральный вклад каждого флуорофора, представлены на рис.3. Нормированные значения интенсивности (после вычитания фонового сигнала), соответствующие каждому флуорофору, изображены на рис.4. Данные графики представляют собой эталонные спектры флуорофоров, используемые в алгоритме спектрального разделения. Затем изображения из зарегистрированной последовательности использовались вместе в алгоритме разделения спектральных данных (см."Материалы и методы") для спектрального разделения изображений всех флуорофоров (рис.5).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Фильтры серии VersaChrome® могут быть размещены на пути излучения, возбуждающего образец, и флуоресцентного излучения. По мере того как меняется угол падения на фильтр пучка излучения, можно регистрировать различные спектральные линии. Кроме того, следует отметить, что спектральные характеристики данных перестраиваемых фильтров практически одинаковы для s- и p-поляризованного света. Данную особенность довольно сложно получить при использовании жидкокристаллических и акустооптических перестраиваемых фильтров [2–5]. Нечувствительность к поляризации крайне желательна для спектральных систем визуализации, и кроме того, ограничения на поляризацию излучения для фильтров с токовым управлением могут привести к потере половины сигнала во многих сканирующих спектральных приборах. Использование фильтров VersaChrome® не приводит к таким потерям. Поэтому эти фильтры могут не только увеличить пропускную способность приборов спектральной визуализации, но и упростить конструкцию экспериментального прибора [5].
ЛИТЕРАТУРА
1. Visualization of Microscopy-Based Spectral Imaging Data from Multi-Label Tissue Sections, Mansfield JR, Hoyt C, Richard, RM, Current Protocols in Molecular Biology, 84:14.19.1–14.19.15 2008.
2. Spectral Imaging: Principles and Applications. Garini Y, Young IT, McNamara G., Cytometry A, 69(8):735–47, 2006.
3. Multispectral Imaging Fluorescence Microscopy for Living Cells, Hiraoka Y, Shimi T., and Haraguchi T. Cell Structure and Function, 27: 367–374, 2002.
4. Электронный ресурс: http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/
5. Semrock VersaChrome™ – the First Widely Tunable Thin-film Optical Filters, Erdogan T and Wang L. Электронный ресурс: http://semrock.com/, 2010.
Отзывы читателей
