eng
Выпуск #5/2015
В.Беккер, А.Желзов, В.Чеславский
Визуализация времени жизни флуоресценции с помощью многомерного TCSPC-метода: новые возможности в биомедицине
Визуализация времени жизни флуоресценции с помощью многомерного TCSPC-метода: новые возможности в биомедицине
Просмотры: 7049
Параметры затухания являются показателями молекулярной окружающей среды флуорофоров. Поэтому визуализация времени жизни флуоресценции (Fluorescence Liftime Imaging – FLIM) позволяет получить непосредственную информацию о концентрации ионов, pH-факторе, белках и конфигурации белковых взаимодействий, а также о метаболическом состоянии клеток и тканей.
Теги: biophotonucs flim fluorescence lifetime imaging single photons counting биофотоника визуализация времени жизни флуоресценции счет одиночных фотонов флуоресценция
М
етод FLIM, использующий счет одиночных фотонов с корреляцией по времени (Time Correlated Single Photon Counting – TCSPC), основан на сканировании исследуемого образца импульсным лазерным излучением высокой частоты, регистрации единичных фотонов флуоресцирующего сигнала, формировании распределения фотонов по времени жизни в течение оболучающего лазерного импульса и знании координат лазерного луча в области сканируемого объекта в момент регистрации фотонов. Метод превосходно сочетает в себе преимущества счета фотонов с корреляцией по времени и лазерной сканирующей микроскопии: это обеспечивает почти идеальную эффективность регистрации фотонов, минимальное время облучения образца, высокое временное разрешение, многоэкспоненциальное разложение профилей, а также подавление внефокусного и бокового рассеянного света.[1]
Введение
Методы визуализации, основанные на флуоресценции, нашли широкое применение в исследованиях клеток и живых организмов, потому что они чрезвычайно чувствительны и способны предоставлять информацию о биохимических взаимодействиях на молекулярном уровне. Интенсивность флуоресценции зависит от квантовой эффективности флуоресцинции и концентрации флуорофора. Изображения интенсивности флуоресценции показывают, где в образце находятся флуорофоры, т. е. показывают пространственное строение исследуемого образца. Спектр флуоресценции является характерным для флоурофора. Изображения содержат спектральную информацию, позволяя определить флуорофоры в отдельных пикселах изображения. Время жизни флуоресценции или, точнее, функция затухания флуоресценции зависит от типа флуорофоров, а не от их концентрации. Также она зависит и от молекулярной среды флуорофора. Функция фруоресцентного затухания и, следовательно, флуоресцентные изображения содержат информацию о молекулярном окружении молекул флуорофора или флуоресцентномеченых биомолекул [1–3].
Существует ряд различных методов для обнаружения флуоресценции и совместимости обнаруженной флуоресценции с визуализацией. Разные принципы различаются эффективностью регистрации фотонов, т. е. числом фотонов, необходимых для получения заданной точности времени жизни [4, 5], времени регистрации необходимого для записи этих фотонов, потока фотонов при котором их можно использовать, временным разрешением, их способностью в разложении параметров нескольких экспоненциальных функций распада, многоволновых возможностях, возможностью оптических срезов и совместимостью с различными методами визуализации и микроскопии [1]. В данной статье основной упор сделан на FLIM со счетом одиночных фотонов с корреляцией по времени и на методе лазерного сканирования, который обеспечивает выдающееся сочетание эффективности регистрации фотонов, временное и пространственное разрешение [6].
TCSPC-FLIM
Принцип TCSPC FLIM
Классический метод TCSPC возбуждает образец с помощью импульсного лазера, обнаруживает единичные фотоны флуоресцирующего света и строит распределение фотонов (т.е. гистограммы) плотности фотонов, возбужденных лазерным импульсом от эффективности регистрации фотонов. Этот метод известен с 1961 года [7], полный обзор можно найти в [8]. Ограничением классического метода является то, что он одномерный. Он не передаёт изображения напрямую, и он не может использоваться в сочетании с быстрым сканированием, применяющимся в современных лазерных сканирующих микроскопах [9].
Проблема классического TCSPC-метода была решена с помощью многомерного TCSPC, представленного компанией Becker & Hickl в 1993 году. В данном случае процесс записи формирует распределение фотонов не только с течением времени после импульса возбуждения, но и по другим параметрам, таким как положение лазерного луча в области сканирования в момент регистрации фотона, длина волны фотонов или время от начала эксперимента [6, 10, 11]. Применение многомерного TCSPC-метода в лазерной сканирующей микроскопии показано на рис. 1.
Сканирующая головка микроскопа сканирует исследуемый образец сфокусированным пучком импульсного лазера высокой частоты. Для каждого обнаруженного фотона в TCSPC-приборе определяется время t, период лазерного импульса, местоположение лазерного пятна x, y в области сканирования. Из этих параметров строится распределение фотонов по пространственным координатам x, y и времени фотонов t. Процесс записи продолжается в течение большого числа периодов до тех пор, пока полезный уровень сигнал-шум фотонного распределения не будет достигнут. Более подробная техническая информация приведена в работе [11].
Из всех электронных FLIM-методов многомерный TCSPC-метод обеспечивает наиболее высокое временное разрешение. Он также позволяет получить лучшую точность времени жизни, или эффективность регистрации фотонов, при заданным числе фотонов зарегистрированных от образца [4, 5]. Метод TCSPC-FLIM имеет ряд других особенностей, важных для визуализации времени жизни биологичеких систем: он способен решать сложные профили кинетики затухания и устойчив к динамическим изменениям параметров затухания флуоресценции [5, 11]. Кроме того, метод TCSPC-FLIM прекрасно совместим с конфокальной и многофотонной [9, 12] лазерной сканирующей микроскопией. Он не имеет никаких проблем совместимости с высокой скоростью сканирования используемой в этих системах: процесс записи продолжается в течение всего времения сканирования для получения необходимого соотношения сигнал-шум. Кроме того метод TCSPC FLIM использует оптические срезы конфокального или многофотонного сканирования: данные получены из точно определённой боковой позиции и с точно определённой плоскостью в образце, без загрязнения боковым рассеянием и внефокусной флуоресценцией [6].
На рис. 2 приведен пример данных высокого качества, которые могут быть получены c помощью метода TCSPC-FLIM. Изображение размером 2048 Ч 2048 пикселов и функцией флуоресцентного затухания в отдельных пикселах 256 временных каналов.
Применение метода FLIM в биологии
Измерение параметров молекулярного окружения
Существует широкий спектр флуорофоров, также называемых "датчики" или "пробники", изменение времени жизни которых зависит от локального молекулярного окружения [3]. Широко известными являются датчики концентрации ионов, такие как Oregon Green Bapta для Ca 2+ или MQAE для Cl-. Другие датчики изменяют свое время жизни в зависимости от значения pH или при привязке к ДНК и РНК. Есть также эффекты локальной вязкости, агрегации флуорофора и переноса электронов [1–3, 6, 14]. Пример для измерения Ca 2+ показан на рис. 3.
Преимущество FLIM-метода над методами, основанными на измерениях интенсивности, проявляется в том, что его результаты не зависят от вариаций концентрации флуорофора и поглощения в исследуемом образце.
FRET-эксперименты
Одним из наиболее широких применений метода TCSPC FLIM является измерение белковых взаимодействий и сворачивания белков путём Ферстеровского резонансного переноса энергии (Fцrster resonance energy transfer – FRET) [15, 16]. Белки помечаются двумя красителями с различными спектрами поглощения и излучения. Полосы излучения первого красителя (донора) перекрывают полосы поглощения второго (акцептора). Если расстояние между донором и акцептором меньше нескольких нанометров, то энергия может передаваться непосредственно от донора к акцептору. В результате происходит уменьшение времени затухания флуоресценции донора. Интенсивность передачи энергии, т. е. уменьшение времени затухания, является показателем расстояния между донором и акцептором.
Использование FLIM-метода для FRET-эксперимернтов имеет очевидное преимущество – интенсивность FRET получается из единичного времени жизни донора. Акцепторное изображение не требуется, и утечки донора в акцепторный канал и напрямую возбужденная флуоресценция акцептора не имеет никакого влияния на результат измерения метода FLIM-FRET. Единственное значение, которое требуется для вычисления FRET – это время затухания донора в отсутствие акцептора [17–20]. Зачастую это значение можно получить при помоци анализа кинетки затухания донора двойной экспоненциальной функцией [11].
Пример результата использования метода FLIM-FRET показан на рис. 4. Данные были получены из клеток, экспрессирующих синтез зеленого флуоресцентного белка. Су3-меченое антитело использовали в качестве акцептора для FRET.
Огромное количество FLIM-FRET работ были опубликованы в последние несколько лет, большинство из них с помощью TCSPC FLIM [11].
FLIM автофлуоресценции
Биологическая ткань содержит широкий спектр эндогенных флуорофоров, время жизни которых зависит от локальных параметров окружающей среды, таких как насыщенность кислородом, связь с белками, а главное – состояние метаболизма ткани [14, 21–23]. Данные FLIM содержат прямую биологическую информацию [6]. Дополнительная информация о строении ткани может быть получена при помощи генерации сигналов второй гармоники [24, 25]. Важным аспектом является то, что автофлуоресцентная визуализация не использует экзогенные метки. Поэтому метод может напрямую быть использован в клинических исследованиях.
Автофлуоресцентное изображение биологической ткани может содержать на удивление много деталей (рис.5). На изображениях показан образец кожи свиньи при двухфотонном возбуждении на длине волны 800 нм. На рисунке слева показан канал детекции на длине волны менее 480 нм. Этот канал содержит как флуоресценцию, так и генерацию сигналов второй гармоники. Часть сигнала генерации второй гармоники была получена из данных FLIM и отображается цветом. На правом рисунке показан канал на длине волны больше 480 нм. Он содержит только флуоресценцию, цвет соответствует амплитудно-взвешенному среднему времени затухания полученного из модели двойного экспоненциального распада.
Использование FLIM в клинических исследованиях
При многофотонной томографии человеческой кожи используется лазерное сканирование с помощью сфокусированного фемтосекундного лазерного луча, двухфотонного возбуждения и регистрации сигналов флуоресценции, не требующих десканирования [14, 26]. Методика берет свое начало в работах Граттона, Кенига, Мастерса, Со и Тромберга, которые показали, что в живых организмах двухфотонная визуализация автофлуоресценции клеток и, в особенности, человеческой кожи, может производиться без ущерба для их жизнедеятельности [25, 27–29]. Инструменты для клинического применения методики были разработаны компанией Jenlab GmbH (Йена, Германия) [30]. Поскольку методика основана на быстром сканировании и импульсном возбуждении, то она хорошо сочетается с методом TCSPC-FLIM. На рис. 6 показан зернистый слой человеческой кожи (stratum granulosum), записанный системой Jenlab "Dermainspect" и FLIM-TCSPC системой SPC-152 компании Becker & Hickl.
Для применений, связанных с офтальмологией, в FLIM-методе используется сочетание офтальмологического сканера с одним или двумя пикосекундными диодными лазерами и TCSPC FLIM системой. Подробная техническая информация в работах [6, 11]. Офтальмологический FLIM в настоящее время проходит клинические испытания [31, 32]. Два типовых полученных результата показаны на рис. 7. Изображения были отсканированы с помощью метода FLIO (Fluorescence Lifetime Imaging Ophthalmoscopy) для съёмки времени жизни лазерным офтальмоскопом фирмы Heidelberg Engineering (Германия). Детекторная часть системы имеет два спектральных канала от 490 нм до 560 нм и от 560 нм до 700 нм. Сигналы регистрировались с помощью гибридных детекторов HPM-100 фирмы Becker&Hickl [33] и записывались TCSPC-FLIM модулями для счета фотонов SPC-150. Представлены изображения с длинами волн канала от 560 нм до 700 нм.
Изображения TCSPC-FLIM других органов, могут быть получены путем сканирования через эндоскопы. Оптический принцип был продемонстрировам с хорошими результатами [11]. В настоящее время проблемой является отсутствие клинических испытаний эндоскопов с высокой числовой апертурой и низкой собственной флуоресценцией.
Последние разработки
За последние 10 лет методы FLIM добились впечатляющего прогресса. Обычные фотоэлектронные уможители (ФЭУ) были заменены однофотонными лавинными фотодиодами и гибридными детекторами. Эти детекторы имеют значительно более высокую эффективность регистрации фотонов, чем традиционные ФЭУ. Гибридные детекторы обеспечивают получение более чистых сигналов [33]. Таким образом, они не только регистрируют большее число фотонов, но и позволяют FLIM-системам достигать более высокой точности измерения времени жизни для заданного числа фотонов на пиксел. В последние несколько лет скорость и объем памяти компьютеров увеличились более чем на порядок. 64-разрядные операционные системы и 64-битное программное обеспечение прибора увеличили доступный объём памяти. В результате данные FLIM могут быть записаны с мегапиксельным разрешением [11, 34], как показано на рис.8.
Повышение эффективности помогает избежать искажения результатов исследования, связанных с фотоотбеливанием, фотоповреждением или фотоиндуцированием метаболических изменений в исследуемых образцах. В сочетании с большим объемом памяти для 64-разрядных систем основанных на Windows, метод TCSPC-FLIM может быть расширен с помощью дополнительных параметров фотонов или эксперимента. Одним из таких параметров является спектрально-разрешенный FLIM [5, 12]. Спектр флуоресцирующего света распределяется на матрицу из детекторных каналов. Для каждого фотона определяется время возбуждения лазерным импульсом, номер регистрирующего канала в детекторе, положение х и y лазерного пятна в области сканирования. Эти сведения используются для построения распределения фотонов по времени распада фотонов флуоресценции, по длине волны и координатам изображения. В результате несколько изображений (обычно 16) различной длины волны одновременно записываются в одном TCSPC-канале. Результат показан на рис. 8. Более подробно – в работах [22, 35, 36].
Другой способ добавления дополнительных параметров для построения распределения фотонов в методе FLIM – это "мозаика". Мозаичный FLIM записывает данные последующих записей FLIM в следующие элементы FLIM большего массива данных. Этот метод первоначально был разработан для записи пространственных мозаичных данных при пошаговом перемещении образца [34]. Он может быть также использован для записи Z стеков FLIM данных и для записи быстрых временных рядов [6, 11]. Пример показан на рис.9. Образец – листок мха. Мозаика имеет 64 элемента, каждый записан в течение 1 секунды. В работе использовался микроскоп с конфокальной FLIM-системой DCS-120 компании Becker&Hickl, Время проходит от нижнего левого до верхнего правого угла. Отчетливо видно снижение времени жизни флуоресценции, вызванного нефотохимическим переходом хлорофилла.
С помощью периодической стимуляции образца данная методика способна устранить изменения концентрации Ca 2+ в живых нейронах при временном разрешении 40 мс [6, 11]. Еще более быстрый метод называется флуоресцентным временем жизни переходных процессов сканирования (Fluorescence Lifetime-Transient Scanning – FLITS). Этот метод основан на TCSPC-методике и сканировании отдельных линий. Метод FLITS был представлен для записи динамических эффектов времени жизни флуоресценции при временном разрешении около 1 мс [ 6, 11, 38].
В настоящее время все больший интерес представляет FLIM-метод в ближней ИК-области спектра. В этой области эмиссия экзогенных флуорофоров может быть обнаружена без загрязнения от автофлуоресценции. Кроме того, разложение флуоресценции флуорофоров ближней ИК-области спектра является актуальным для диффузных оптических методов визуализации [5, 6, 11]. Пример ближнего ИК- FLIM-метода с помощью лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 710 NLO показан на рис.10. Технические детали ближнего ИК FLIM описаны в [11] и [37].
Метод TCSPC-FLIM может быть объединен cо STED-микроскопией на основе подавления спонтанного испускания (Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy) [39, 40] и со сканирующей оптической микроскопией ближнего поля (Near-field Scanning Optical Microscopy – NSOM) [11, 40] для получения времени жизни флоуресценции изображения с оптическим суперразрешением. Пример записи STED-FLIM показан на рис. 11.
Метод TCSPC-FLIM способен одновременно записывать визуализацию флуоресценциии (FLIM) и изображения фосфоресценции времени жизни (PLIM). Методика основана на модулирующем включении-выключении высокочастотного импульсного лазера, и записи двух времен для каждого детектированого фотона. Одно время – от предыдущего возбуждения импульса, другое – от модуляции импульсов [11, 42].
Пример показан на рис.12: дрожжевые клетки, окрашенные флуоресцентным веществом (2,2’-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate. На временной шкале пикосекундного масштаба обнаружена автофлоуресценция NADH и FAD. Фосфоресценция красителя рутения зафиксирована в микросекундном масштабе. Изображение времени жизни флуоресценции показано на рисунке слева, изображение справа – время жизни фосфоресценции.
Методы, основанные на комбинации конфокальной или двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии с TCSPC, в принципе, также способны записывать данные флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS-следы) и FRET единчных молекул [6, 11]. Пример FCS записи представлен на рис. 13.
Заключение
Сочетание многомерного TCSPС-метода и лазерного сканирующего микроскопа позволяет записать визуализацию время жизни флуоресценции почти с идеальной эффективностью регистрации фотонов и превосходным временным и пространственным разрешением. Этот метод может быть расширен, чтобы записывать изображения на нескольких длинах волн, пространственные мозаики и Z-стеки FLIM-изображений, а также быстрые временные серии, показывающие динамическое изменение в поведении флуоресценции исследуемого образца. Кроме того, флуоресцентное изображение времени жизни может быть записано одновременно с фосфоресцентным изображением времени жизни. Метод TCSPC-FLIM может быть объединен со STED, в результате чего FLIM-изображения будут записаны с оптическим суперразрешением. Типовым применением FLIM-метода является отображение локальных молекулярных параметров окружающей среды, белковых взаимодействий по FRET-методу и визуализация автофлуоресценции. Клиническое применение находится на стадии клинических испытаний.
Литература
1. W. Becker. Fluorescence Lifetime Imaging – Techniques and Applications. – J. Microsc., 247, 119–136 (2012).
2. M.Y. Berezin, S. Achilefu. Fluorescence lifetime maesurement and biological imaging. – Chem. Rev., 110, 2641–2684 (2010).
3. J.R. Lakowicz.Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd edn.: Springer (2006).
4. M. Kцllner, J. Wolfrum, How many photons are necessary for fluorescence-lifetime measurements? – Phys. Chem. Lett., 200, 199–204 (1992).
5. J.P. Philip and K. Carlsson. Theoretical investigation of the signal-to-noise ratio in fluorescence lifetime imaging, – J. Opt. Soc. Am., A20, 368–379 (2003).
6. W. Becker (ed.). Advanced time-correlated single photon counting applications: Springer, Berlin, Heidelberg, New York (2015).
7. L. M. Bollinger, G. E. Thomas. Measurement of the time tependence of scintillation intensity by a delayed coincidence method. – Rev.Sci. Instrum., 32, 1044–1050 (1961).
8. D.V. O’Connor, D. Phillips. Time-correlated single photon counting: Academic Press, London (1984).
9. J. Pawley (ed.). Handbook of biological confocal microscopy, 3rd edn.: Springer (2006).
10. W. Becker. Advanced time-correlated single-photon counting techniques: – Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 2005.
11. W. Becker. The bh TCSPC handbook. 6th edition: Becker & Hickl GmbH (2015), available on www.becker-hickl.com.
12. Diaspro A. (ed.). Confocal and two-photon microscopy: Foundations, applications and advances: Wiley-Liss (2001).
13. Becker & Hickl GmbH, DCS-120 Confocal Scanning FLIM Systems, user handbook, 6th ed. (2015), available on www.becker-hickl.com.
14. Roberts M. S., Dancik Y., Prow T.W., Thorling C.A., Li L., Grice J.E., Robertson T.A., Kцnig K., Becker W. Non-invasive imaging of skin physiology and percutaneous penetration using fluorescence spectral and lifetime imaging with multiphoton and confocal microscopy.– European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 77, 469–488 (2011).
15. Th. Fцrster, Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. – Ann. Phys. (Serie 6) 2, 55–75 (1948).
16. Th. Fцrster. Energy migration and fluorescence. Translated by Klaus Suhling. – J. Biomed. Opt. 17 011002–1 to –10.
17. C. Biskup, L. Kelbauskas, T. Zimmer, K. Benndorf, A. Bergmann, W. Becker, J.P. Ruppersberg, C. Stockklausner, N. Klцcker. Interaction of PSD-95 with potassium channels visualized by fluorescence lifetime-based resonance energy transfer imaging. – J. Biomed., Opt. 9, 735–759 (2004).
18. Y. Chen, A. Periasamy, Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization.– Microsc. Res. Tech., 63, 72–80 (2004).
19. R.R. Duncan, A. Bergmann, M.A. Cousin, D.K. Apps, M.J. Shipston. Multi-dimensional time-correlated single-photon counting (TCSPC) fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to detect FRET in cells.– J. Microsc., 215, 1–12 (2004).
20. Periasamy, R.M. Clegg, eds. FLIM Microscopy in Biology and Medicine: CRC Press, 2009.
21. D.K. Bird, L. Yan, K. M. Vrotsos, K. E. Eliceiri, E. M. Vaughan. Metabolic mapping of MCF10A human breast cells via multiphoton fluorescence lifetime imaging of coenzyme NADH: Cancer Res. 65:8766–8773 (2005).
22. D. Chorvat, A. Chorvatova. Multi-wavelength fluorescence lifetime spectroscopy: a new approach to the study of endogenous fluorescence in living cells and tissues. – Laser Phys. Lett., 6 175–193 (2009).
23. M. C. Skala, K. M. Riching, D. K. Bird, A. Dendron-Fitzpatrick, J. Eickhoff, K. W. Eliceiri, P. J. Keely, N. Ramanujam. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia.– J. Biomed., Opt. 12 02401–1 to 10 (2007).
24. M. J. Koehler, K. Kцnig, P. Elsner, R. Bьckle, M. Kaatz. In vivo assessment of human skin aging by multiphoton laser scanning tomography. – Opt. Lett., 31, 2879–2881 (2006).
25. B.R. Masters, P.T.C. So, eds. Handbook of Biomedical Nonlinear Optical Microscopy:Oxford University Press, 2008.
26. K. Kцnig, Clinical multiphoton tomography. – J. Biophoton.,1, 13–23 (2008).
27. K. Kцnig, P.T.C. So, W.W. Mantulin, B.J. Tromberg, E. Gratton, Two-Photon excited lifetime imaging of autofluorescence in cells during UVA and NIR photostress. – J. Microsc. 183, 197–204 (1996).
28. K. Kцnig, Multiphoton microscopy in life sciences. – J. Microsc., 200, 83–104 (2000).
29. B. R. Masters, P.T.C. So. Multi-photon excitation microscopy and confocal microscopy imaging of in vivo human skin: A comparison. – Microscopy and Microanalysis, 5, 282–289 (1999).
30. Jenlab GmbH, MPT Flex Multiphoton Laser Tomography. www.jenlab.de/MPTflex.114.0.html.
31. C. Dysli, G. Quellec, M Abegg, M. N. Menke, U. Wolf-Schnurrbusch, J. Kowal, J. Blatz, O. La Schiazza, A. B. Leichtle, S. Wolf, M. S. Zinkernagel. Quantitative Analysis of Fluorescence Lifetime Measurements of the Macula Using the Fluorescence Lifetime Imaging Ophthalmoscope in Healthy Subjects: IOVS 55, 2107–2113 (2014).
32. D. Schweitzer. Metabolic Mapping. In: F.G. Holz, R.F. Spaide (eds), Medical retina, Essential in Opthalmology: Springer (2010).
33. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub. FLIM and FCS Detection in Laser-Scanning Microscopes: Increased Efficiency by GaAsP Hybrid Detectors. – Micr. Res. Tech., 74, 804–811 (2011).
34. H. Studier, W. Becker. Megapixel FLIM. – Proc. SPIE, 8948 (2014).
35. W. Becker, A. Bergmann, C. Biskup. Multi-Spectral Fluorescence Lifetime Imaging by TCSPC.– Micr. Res. Tech., 70, 403–409 (2007).
36. Rьck, Ch.Hьlshoff, I.Kinzler, W.Becker, R. Steiner. SLIM: A New Method for Molecular Imaging. – Micr. Res. Tech., 70, 403–409 (2007).
37. W. Becker, V. Shcheslavskiy. Fluorescence lifetime imaging with near-infrared dyes.– Photon Lasers Med., 4, 73–83, 2015.
38. W. Becker, V. Shcheslavkiy, S. Frere, I. Slutsky. Spatially Resolved Recording of Transient Fluorescence-Lifetime Effects by Line-Scanning TCSPC. – Microsc. Res. Techn., 77, 216–224 (2014).
39. J. Bьckers, D. Wildanger, G. Vicidomini, L. Kastrup, S.W. Hell. Simultaneous multi-lifetime multi-colour STED imaging for colocalization anlysis. – Opt. Expr., 19, 3130–3143 (2011).
40. M. D. Lesoine, S. Bose, J. W. Petrich, E. A. Smith. Supercontinuum Stimulated Emission Depletion Fluorescence Lifetime Imaging.– J. Phy. Chem. B, 116, 7821–7826 (2012).
41. M. Micic, D. Hu, Y.D. Suh, G. Newton, M. Romine, H.P. Lu, Correlated atomic force microscopy and fluorescence lifetime imaging of live bacterial cells.– Colloids and Surfaces B, Biointerfaces ,34, 205–212 (2004).
42. W. Becker, B. Su, A. Bergmann, K. Weisshart, O. Holub. Simultaneous Fluorescence and Phosphorescence Lifetime Imaging. – Proc. SPIE, 7903 (2011).
етод FLIM, использующий счет одиночных фотонов с корреляцией по времени (Time Correlated Single Photon Counting – TCSPC), основан на сканировании исследуемого образца импульсным лазерным излучением высокой частоты, регистрации единичных фотонов флуоресцирующего сигнала, формировании распределения фотонов по времени жизни в течение оболучающего лазерного импульса и знании координат лазерного луча в области сканируемого объекта в момент регистрации фотонов. Метод превосходно сочетает в себе преимущества счета фотонов с корреляцией по времени и лазерной сканирующей микроскопии: это обеспечивает почти идеальную эффективность регистрации фотонов, минимальное время облучения образца, высокое временное разрешение, многоэкспоненциальное разложение профилей, а также подавление внефокусного и бокового рассеянного света.[1]
Введение
Методы визуализации, основанные на флуоресценции, нашли широкое применение в исследованиях клеток и живых организмов, потому что они чрезвычайно чувствительны и способны предоставлять информацию о биохимических взаимодействиях на молекулярном уровне. Интенсивность флуоресценции зависит от квантовой эффективности флуоресцинции и концентрации флуорофора. Изображения интенсивности флуоресценции показывают, где в образце находятся флуорофоры, т. е. показывают пространственное строение исследуемого образца. Спектр флуоресценции является характерным для флоурофора. Изображения содержат спектральную информацию, позволяя определить флуорофоры в отдельных пикселах изображения. Время жизни флуоресценции или, точнее, функция затухания флуоресценции зависит от типа флуорофоров, а не от их концентрации. Также она зависит и от молекулярной среды флуорофора. Функция фруоресцентного затухания и, следовательно, флуоресцентные изображения содержат информацию о молекулярном окружении молекул флуорофора или флуоресцентномеченых биомолекул [1–3].
Существует ряд различных методов для обнаружения флуоресценции и совместимости обнаруженной флуоресценции с визуализацией. Разные принципы различаются эффективностью регистрации фотонов, т. е. числом фотонов, необходимых для получения заданной точности времени жизни [4, 5], времени регистрации необходимого для записи этих фотонов, потока фотонов при котором их можно использовать, временным разрешением, их способностью в разложении параметров нескольких экспоненциальных функций распада, многоволновых возможностях, возможностью оптических срезов и совместимостью с различными методами визуализации и микроскопии [1]. В данной статье основной упор сделан на FLIM со счетом одиночных фотонов с корреляцией по времени и на методе лазерного сканирования, который обеспечивает выдающееся сочетание эффективности регистрации фотонов, временное и пространственное разрешение [6].
TCSPC-FLIM
Принцип TCSPC FLIM
Классический метод TCSPC возбуждает образец с помощью импульсного лазера, обнаруживает единичные фотоны флуоресцирующего света и строит распределение фотонов (т.е. гистограммы) плотности фотонов, возбужденных лазерным импульсом от эффективности регистрации фотонов. Этот метод известен с 1961 года [7], полный обзор можно найти в [8]. Ограничением классического метода является то, что он одномерный. Он не передаёт изображения напрямую, и он не может использоваться в сочетании с быстрым сканированием, применяющимся в современных лазерных сканирующих микроскопах [9].
Проблема классического TCSPC-метода была решена с помощью многомерного TCSPC, представленного компанией Becker & Hickl в 1993 году. В данном случае процесс записи формирует распределение фотонов не только с течением времени после импульса возбуждения, но и по другим параметрам, таким как положение лазерного луча в области сканирования в момент регистрации фотона, длина волны фотонов или время от начала эксперимента [6, 10, 11]. Применение многомерного TCSPC-метода в лазерной сканирующей микроскопии показано на рис. 1.
Сканирующая головка микроскопа сканирует исследуемый образец сфокусированным пучком импульсного лазера высокой частоты. Для каждого обнаруженного фотона в TCSPC-приборе определяется время t, период лазерного импульса, местоположение лазерного пятна x, y в области сканирования. Из этих параметров строится распределение фотонов по пространственным координатам x, y и времени фотонов t. Процесс записи продолжается в течение большого числа периодов до тех пор, пока полезный уровень сигнал-шум фотонного распределения не будет достигнут. Более подробная техническая информация приведена в работе [11].
Из всех электронных FLIM-методов многомерный TCSPC-метод обеспечивает наиболее высокое временное разрешение. Он также позволяет получить лучшую точность времени жизни, или эффективность регистрации фотонов, при заданным числе фотонов зарегистрированных от образца [4, 5]. Метод TCSPC-FLIM имеет ряд других особенностей, важных для визуализации времени жизни биологичеких систем: он способен решать сложные профили кинетики затухания и устойчив к динамическим изменениям параметров затухания флуоресценции [5, 11]. Кроме того, метод TCSPC-FLIM прекрасно совместим с конфокальной и многофотонной [9, 12] лазерной сканирующей микроскопией. Он не имеет никаких проблем совместимости с высокой скоростью сканирования используемой в этих системах: процесс записи продолжается в течение всего времения сканирования для получения необходимого соотношения сигнал-шум. Кроме того метод TCSPC FLIM использует оптические срезы конфокального или многофотонного сканирования: данные получены из точно определённой боковой позиции и с точно определённой плоскостью в образце, без загрязнения боковым рассеянием и внефокусной флуоресценцией [6].
На рис. 2 приведен пример данных высокого качества, которые могут быть получены c помощью метода TCSPC-FLIM. Изображение размером 2048 Ч 2048 пикселов и функцией флуоресцентного затухания в отдельных пикселах 256 временных каналов.
Применение метода FLIM в биологии
Измерение параметров молекулярного окружения
Существует широкий спектр флуорофоров, также называемых "датчики" или "пробники", изменение времени жизни которых зависит от локального молекулярного окружения [3]. Широко известными являются датчики концентрации ионов, такие как Oregon Green Bapta для Ca 2+ или MQAE для Cl-. Другие датчики изменяют свое время жизни в зависимости от значения pH или при привязке к ДНК и РНК. Есть также эффекты локальной вязкости, агрегации флуорофора и переноса электронов [1–3, 6, 14]. Пример для измерения Ca 2+ показан на рис. 3.
Преимущество FLIM-метода над методами, основанными на измерениях интенсивности, проявляется в том, что его результаты не зависят от вариаций концентрации флуорофора и поглощения в исследуемом образце.
FRET-эксперименты
Одним из наиболее широких применений метода TCSPC FLIM является измерение белковых взаимодействий и сворачивания белков путём Ферстеровского резонансного переноса энергии (Fцrster resonance energy transfer – FRET) [15, 16]. Белки помечаются двумя красителями с различными спектрами поглощения и излучения. Полосы излучения первого красителя (донора) перекрывают полосы поглощения второго (акцептора). Если расстояние между донором и акцептором меньше нескольких нанометров, то энергия может передаваться непосредственно от донора к акцептору. В результате происходит уменьшение времени затухания флуоресценции донора. Интенсивность передачи энергии, т. е. уменьшение времени затухания, является показателем расстояния между донором и акцептором.
Использование FLIM-метода для FRET-эксперимернтов имеет очевидное преимущество – интенсивность FRET получается из единичного времени жизни донора. Акцепторное изображение не требуется, и утечки донора в акцепторный канал и напрямую возбужденная флуоресценция акцептора не имеет никакого влияния на результат измерения метода FLIM-FRET. Единственное значение, которое требуется для вычисления FRET – это время затухания донора в отсутствие акцептора [17–20]. Зачастую это значение можно получить при помоци анализа кинетки затухания донора двойной экспоненциальной функцией [11].
Пример результата использования метода FLIM-FRET показан на рис. 4. Данные были получены из клеток, экспрессирующих синтез зеленого флуоресцентного белка. Су3-меченое антитело использовали в качестве акцептора для FRET.
Огромное количество FLIM-FRET работ были опубликованы в последние несколько лет, большинство из них с помощью TCSPC FLIM [11].
FLIM автофлуоресценции
Биологическая ткань содержит широкий спектр эндогенных флуорофоров, время жизни которых зависит от локальных параметров окружающей среды, таких как насыщенность кислородом, связь с белками, а главное – состояние метаболизма ткани [14, 21–23]. Данные FLIM содержат прямую биологическую информацию [6]. Дополнительная информация о строении ткани может быть получена при помощи генерации сигналов второй гармоники [24, 25]. Важным аспектом является то, что автофлуоресцентная визуализация не использует экзогенные метки. Поэтому метод может напрямую быть использован в клинических исследованиях.
Автофлуоресцентное изображение биологической ткани может содержать на удивление много деталей (рис.5). На изображениях показан образец кожи свиньи при двухфотонном возбуждении на длине волны 800 нм. На рисунке слева показан канал детекции на длине волны менее 480 нм. Этот канал содержит как флуоресценцию, так и генерацию сигналов второй гармоники. Часть сигнала генерации второй гармоники была получена из данных FLIM и отображается цветом. На правом рисунке показан канал на длине волны больше 480 нм. Он содержит только флуоресценцию, цвет соответствует амплитудно-взвешенному среднему времени затухания полученного из модели двойного экспоненциального распада.
Использование FLIM в клинических исследованиях
При многофотонной томографии человеческой кожи используется лазерное сканирование с помощью сфокусированного фемтосекундного лазерного луча, двухфотонного возбуждения и регистрации сигналов флуоресценции, не требующих десканирования [14, 26]. Методика берет свое начало в работах Граттона, Кенига, Мастерса, Со и Тромберга, которые показали, что в живых организмах двухфотонная визуализация автофлуоресценции клеток и, в особенности, человеческой кожи, может производиться без ущерба для их жизнедеятельности [25, 27–29]. Инструменты для клинического применения методики были разработаны компанией Jenlab GmbH (Йена, Германия) [30]. Поскольку методика основана на быстром сканировании и импульсном возбуждении, то она хорошо сочетается с методом TCSPC-FLIM. На рис. 6 показан зернистый слой человеческой кожи (stratum granulosum), записанный системой Jenlab "Dermainspect" и FLIM-TCSPC системой SPC-152 компании Becker & Hickl.
Для применений, связанных с офтальмологией, в FLIM-методе используется сочетание офтальмологического сканера с одним или двумя пикосекундными диодными лазерами и TCSPC FLIM системой. Подробная техническая информация в работах [6, 11]. Офтальмологический FLIM в настоящее время проходит клинические испытания [31, 32]. Два типовых полученных результата показаны на рис. 7. Изображения были отсканированы с помощью метода FLIO (Fluorescence Lifetime Imaging Ophthalmoscopy) для съёмки времени жизни лазерным офтальмоскопом фирмы Heidelberg Engineering (Германия). Детекторная часть системы имеет два спектральных канала от 490 нм до 560 нм и от 560 нм до 700 нм. Сигналы регистрировались с помощью гибридных детекторов HPM-100 фирмы Becker&Hickl [33] и записывались TCSPC-FLIM модулями для счета фотонов SPC-150. Представлены изображения с длинами волн канала от 560 нм до 700 нм.
Изображения TCSPC-FLIM других органов, могут быть получены путем сканирования через эндоскопы. Оптический принцип был продемонстрировам с хорошими результатами [11]. В настоящее время проблемой является отсутствие клинических испытаний эндоскопов с высокой числовой апертурой и низкой собственной флуоресценцией.
Последние разработки
За последние 10 лет методы FLIM добились впечатляющего прогресса. Обычные фотоэлектронные уможители (ФЭУ) были заменены однофотонными лавинными фотодиодами и гибридными детекторами. Эти детекторы имеют значительно более высокую эффективность регистрации фотонов, чем традиционные ФЭУ. Гибридные детекторы обеспечивают получение более чистых сигналов [33]. Таким образом, они не только регистрируют большее число фотонов, но и позволяют FLIM-системам достигать более высокой точности измерения времени жизни для заданного числа фотонов на пиксел. В последние несколько лет скорость и объем памяти компьютеров увеличились более чем на порядок. 64-разрядные операционные системы и 64-битное программное обеспечение прибора увеличили доступный объём памяти. В результате данные FLIM могут быть записаны с мегапиксельным разрешением [11, 34], как показано на рис.8.
Повышение эффективности помогает избежать искажения результатов исследования, связанных с фотоотбеливанием, фотоповреждением или фотоиндуцированием метаболических изменений в исследуемых образцах. В сочетании с большим объемом памяти для 64-разрядных систем основанных на Windows, метод TCSPC-FLIM может быть расширен с помощью дополнительных параметров фотонов или эксперимента. Одним из таких параметров является спектрально-разрешенный FLIM [5, 12]. Спектр флуоресцирующего света распределяется на матрицу из детекторных каналов. Для каждого фотона определяется время возбуждения лазерным импульсом, номер регистрирующего канала в детекторе, положение х и y лазерного пятна в области сканирования. Эти сведения используются для построения распределения фотонов по времени распада фотонов флуоресценции, по длине волны и координатам изображения. В результате несколько изображений (обычно 16) различной длины волны одновременно записываются в одном TCSPC-канале. Результат показан на рис. 8. Более подробно – в работах [22, 35, 36].
Другой способ добавления дополнительных параметров для построения распределения фотонов в методе FLIM – это "мозаика". Мозаичный FLIM записывает данные последующих записей FLIM в следующие элементы FLIM большего массива данных. Этот метод первоначально был разработан для записи пространственных мозаичных данных при пошаговом перемещении образца [34]. Он может быть также использован для записи Z стеков FLIM данных и для записи быстрых временных рядов [6, 11]. Пример показан на рис.9. Образец – листок мха. Мозаика имеет 64 элемента, каждый записан в течение 1 секунды. В работе использовался микроскоп с конфокальной FLIM-системой DCS-120 компании Becker&Hickl, Время проходит от нижнего левого до верхнего правого угла. Отчетливо видно снижение времени жизни флуоресценции, вызванного нефотохимическим переходом хлорофилла.
С помощью периодической стимуляции образца данная методика способна устранить изменения концентрации Ca 2+ в живых нейронах при временном разрешении 40 мс [6, 11]. Еще более быстрый метод называется флуоресцентным временем жизни переходных процессов сканирования (Fluorescence Lifetime-Transient Scanning – FLITS). Этот метод основан на TCSPC-методике и сканировании отдельных линий. Метод FLITS был представлен для записи динамических эффектов времени жизни флуоресценции при временном разрешении около 1 мс [ 6, 11, 38].
В настоящее время все больший интерес представляет FLIM-метод в ближней ИК-области спектра. В этой области эмиссия экзогенных флуорофоров может быть обнаружена без загрязнения от автофлуоресценции. Кроме того, разложение флуоресценции флуорофоров ближней ИК-области спектра является актуальным для диффузных оптических методов визуализации [5, 6, 11]. Пример ближнего ИК- FLIM-метода с помощью лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 710 NLO показан на рис.10. Технические детали ближнего ИК FLIM описаны в [11] и [37].
Метод TCSPC-FLIM может быть объединен cо STED-микроскопией на основе подавления спонтанного испускания (Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy) [39, 40] и со сканирующей оптической микроскопией ближнего поля (Near-field Scanning Optical Microscopy – NSOM) [11, 40] для получения времени жизни флоуресценции изображения с оптическим суперразрешением. Пример записи STED-FLIM показан на рис. 11.
Метод TCSPC-FLIM способен одновременно записывать визуализацию флуоресценциии (FLIM) и изображения фосфоресценции времени жизни (PLIM). Методика основана на модулирующем включении-выключении высокочастотного импульсного лазера, и записи двух времен для каждого детектированого фотона. Одно время – от предыдущего возбуждения импульса, другое – от модуляции импульсов [11, 42].
Пример показан на рис.12: дрожжевые клетки, окрашенные флуоресцентным веществом (2,2’-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate. На временной шкале пикосекундного масштаба обнаружена автофлоуресценция NADH и FAD. Фосфоресценция красителя рутения зафиксирована в микросекундном масштабе. Изображение времени жизни флуоресценции показано на рисунке слева, изображение справа – время жизни фосфоресценции.
Методы, основанные на комбинации конфокальной или двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии с TCSPC, в принципе, также способны записывать данные флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS-следы) и FRET единчных молекул [6, 11]. Пример FCS записи представлен на рис. 13.
Заключение
Сочетание многомерного TCSPС-метода и лазерного сканирующего микроскопа позволяет записать визуализацию время жизни флуоресценции почти с идеальной эффективностью регистрации фотонов и превосходным временным и пространственным разрешением. Этот метод может быть расширен, чтобы записывать изображения на нескольких длинах волн, пространственные мозаики и Z-стеки FLIM-изображений, а также быстрые временные серии, показывающие динамическое изменение в поведении флуоресценции исследуемого образца. Кроме того, флуоресцентное изображение времени жизни может быть записано одновременно с фосфоресцентным изображением времени жизни. Метод TCSPC-FLIM может быть объединен со STED, в результате чего FLIM-изображения будут записаны с оптическим суперразрешением. Типовым применением FLIM-метода является отображение локальных молекулярных параметров окружающей среды, белковых взаимодействий по FRET-методу и визуализация автофлуоресценции. Клиническое применение находится на стадии клинических испытаний.
Литература
1. W. Becker. Fluorescence Lifetime Imaging – Techniques and Applications. – J. Microsc., 247, 119–136 (2012).
2. M.Y. Berezin, S. Achilefu. Fluorescence lifetime maesurement and biological imaging. – Chem. Rev., 110, 2641–2684 (2010).
3. J.R. Lakowicz.Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd edn.: Springer (2006).
4. M. Kцllner, J. Wolfrum, How many photons are necessary for fluorescence-lifetime measurements? – Phys. Chem. Lett., 200, 199–204 (1992).
5. J.P. Philip and K. Carlsson. Theoretical investigation of the signal-to-noise ratio in fluorescence lifetime imaging, – J. Opt. Soc. Am., A20, 368–379 (2003).
6. W. Becker (ed.). Advanced time-correlated single photon counting applications: Springer, Berlin, Heidelberg, New York (2015).
7. L. M. Bollinger, G. E. Thomas. Measurement of the time tependence of scintillation intensity by a delayed coincidence method. – Rev.Sci. Instrum., 32, 1044–1050 (1961).
8. D.V. O’Connor, D. Phillips. Time-correlated single photon counting: Academic Press, London (1984).
9. J. Pawley (ed.). Handbook of biological confocal microscopy, 3rd edn.: Springer (2006).
10. W. Becker. Advanced time-correlated single-photon counting techniques: – Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 2005.
11. W. Becker. The bh TCSPC handbook. 6th edition: Becker & Hickl GmbH (2015), available on www.becker-hickl.com.
12. Diaspro A. (ed.). Confocal and two-photon microscopy: Foundations, applications and advances: Wiley-Liss (2001).
13. Becker & Hickl GmbH, DCS-120 Confocal Scanning FLIM Systems, user handbook, 6th ed. (2015), available on www.becker-hickl.com.
14. Roberts M. S., Dancik Y., Prow T.W., Thorling C.A., Li L., Grice J.E., Robertson T.A., Kцnig K., Becker W. Non-invasive imaging of skin physiology and percutaneous penetration using fluorescence spectral and lifetime imaging with multiphoton and confocal microscopy.– European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 77, 469–488 (2011).
15. Th. Fцrster, Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. – Ann. Phys. (Serie 6) 2, 55–75 (1948).
16. Th. Fцrster. Energy migration and fluorescence. Translated by Klaus Suhling. – J. Biomed. Opt. 17 011002–1 to –10.
17. C. Biskup, L. Kelbauskas, T. Zimmer, K. Benndorf, A. Bergmann, W. Becker, J.P. Ruppersberg, C. Stockklausner, N. Klцcker. Interaction of PSD-95 with potassium channels visualized by fluorescence lifetime-based resonance energy transfer imaging. – J. Biomed., Opt. 9, 735–759 (2004).
18. Y. Chen, A. Periasamy, Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization.– Microsc. Res. Tech., 63, 72–80 (2004).
19. R.R. Duncan, A. Bergmann, M.A. Cousin, D.K. Apps, M.J. Shipston. Multi-dimensional time-correlated single-photon counting (TCSPC) fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to detect FRET in cells.– J. Microsc., 215, 1–12 (2004).
20. Periasamy, R.M. Clegg, eds. FLIM Microscopy in Biology and Medicine: CRC Press, 2009.
21. D.K. Bird, L. Yan, K. M. Vrotsos, K. E. Eliceiri, E. M. Vaughan. Metabolic mapping of MCF10A human breast cells via multiphoton fluorescence lifetime imaging of coenzyme NADH: Cancer Res. 65:8766–8773 (2005).
22. D. Chorvat, A. Chorvatova. Multi-wavelength fluorescence lifetime spectroscopy: a new approach to the study of endogenous fluorescence in living cells and tissues. – Laser Phys. Lett., 6 175–193 (2009).
23. M. C. Skala, K. M. Riching, D. K. Bird, A. Dendron-Fitzpatrick, J. Eickhoff, K. W. Eliceiri, P. J. Keely, N. Ramanujam. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia.– J. Biomed., Opt. 12 02401–1 to 10 (2007).
24. M. J. Koehler, K. Kцnig, P. Elsner, R. Bьckle, M. Kaatz. In vivo assessment of human skin aging by multiphoton laser scanning tomography. – Opt. Lett., 31, 2879–2881 (2006).
25. B.R. Masters, P.T.C. So, eds. Handbook of Biomedical Nonlinear Optical Microscopy:Oxford University Press, 2008.
26. K. Kцnig, Clinical multiphoton tomography. – J. Biophoton.,1, 13–23 (2008).
27. K. Kцnig, P.T.C. So, W.W. Mantulin, B.J. Tromberg, E. Gratton, Two-Photon excited lifetime imaging of autofluorescence in cells during UVA and NIR photostress. – J. Microsc. 183, 197–204 (1996).
28. K. Kцnig, Multiphoton microscopy in life sciences. – J. Microsc., 200, 83–104 (2000).
29. B. R. Masters, P.T.C. So. Multi-photon excitation microscopy and confocal microscopy imaging of in vivo human skin: A comparison. – Microscopy and Microanalysis, 5, 282–289 (1999).
30. Jenlab GmbH, MPT Flex Multiphoton Laser Tomography. www.jenlab.de/MPTflex.114.0.html.
31. C. Dysli, G. Quellec, M Abegg, M. N. Menke, U. Wolf-Schnurrbusch, J. Kowal, J. Blatz, O. La Schiazza, A. B. Leichtle, S. Wolf, M. S. Zinkernagel. Quantitative Analysis of Fluorescence Lifetime Measurements of the Macula Using the Fluorescence Lifetime Imaging Ophthalmoscope in Healthy Subjects: IOVS 55, 2107–2113 (2014).
32. D. Schweitzer. Metabolic Mapping. In: F.G. Holz, R.F. Spaide (eds), Medical retina, Essential in Opthalmology: Springer (2010).
33. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub. FLIM and FCS Detection in Laser-Scanning Microscopes: Increased Efficiency by GaAsP Hybrid Detectors. – Micr. Res. Tech., 74, 804–811 (2011).
34. H. Studier, W. Becker. Megapixel FLIM. – Proc. SPIE, 8948 (2014).
35. W. Becker, A. Bergmann, C. Biskup. Multi-Spectral Fluorescence Lifetime Imaging by TCSPC.– Micr. Res. Tech., 70, 403–409 (2007).
36. Rьck, Ch.Hьlshoff, I.Kinzler, W.Becker, R. Steiner. SLIM: A New Method for Molecular Imaging. – Micr. Res. Tech., 70, 403–409 (2007).
37. W. Becker, V. Shcheslavskiy. Fluorescence lifetime imaging with near-infrared dyes.– Photon Lasers Med., 4, 73–83, 2015.
38. W. Becker, V. Shcheslavkiy, S. Frere, I. Slutsky. Spatially Resolved Recording of Transient Fluorescence-Lifetime Effects by Line-Scanning TCSPC. – Microsc. Res. Techn., 77, 216–224 (2014).
39. J. Bьckers, D. Wildanger, G. Vicidomini, L. Kastrup, S.W. Hell. Simultaneous multi-lifetime multi-colour STED imaging for colocalization anlysis. – Opt. Expr., 19, 3130–3143 (2011).
40. M. D. Lesoine, S. Bose, J. W. Petrich, E. A. Smith. Supercontinuum Stimulated Emission Depletion Fluorescence Lifetime Imaging.– J. Phy. Chem. B, 116, 7821–7826 (2012).
41. M. Micic, D. Hu, Y.D. Suh, G. Newton, M. Romine, H.P. Lu, Correlated atomic force microscopy and fluorescence lifetime imaging of live bacterial cells.– Colloids and Surfaces B, Biointerfaces ,34, 205–212 (2004).
42. W. Becker, B. Su, A. Bergmann, K. Weisshart, O. Holub. Simultaneous Fluorescence and Phosphorescence Lifetime Imaging. – Proc. SPIE, 7903 (2011).
Отзывы читателей
