eng
Выпуск #4/2015
Н.Олофсон, Я.Лазаридис, К.Мелетис, М.Карлен, Ульф Тингстром, Хакан Карлссон
Лазеры, усовершенствующие исследования в оптогенетике
Лазеры, усовершенствующие исследования в оптогенетике
Просмотры: 4731
Светочувствительными нейронами можно управлять с помощью света с очень большой временной и пространственной точностью, соответствующей нормальной обработке информации головным мозгом. Выбор лазерного источника для оптогенетики проблема довольно деликатная. В статье обсуждается вопрос, на какие параметры лазера нужно обратить особое внимание.
Теги: opsins optogenetics опсины оптогенетика
Кратко об оптогенетике[1]
История концепции оптогенетики восходит к 1970-м годам, когда доктор Фрэнсис Крик, один из открывателей ДНК, описал словами, что в неврологии необходим метод управления нервными клетками одного типа, оставляя другие клетки не затронутыми, чтобы понять, как работает головной мозг [1]. Крик позже предположил, что таким средством управления нейронами извне будет свет. Свет позволит синхронизовать с произвольной временной точностью соответствующие сигналы, обрабатываемые мозгом.
Независимо от исследований Фрэнсиса Крика биологами того времени были выявлены микроорганизмы, способные регулировать поток ионов (электрический заряд) через их мембраны с помощью светочувствительных белков (опсины). Основываясь на том, что активность нейронов регулируется потоком ионов через плазматическую мембрану, ученые в конце 1990-х годов начали исследовать применение светочувствительных белков для контроля нейронов, но исследователи не признавали опсины как пригодные для неврологии до 2000-х годов. Совместные усилия нескольких исследовательских групп принесли свои плоды только в 2005 году. Тогда впервые свет и однокомпонентный светочувствительный ионный канал были использованы для активации нейронов, что приводило к изменению поведения исследуемого животного [2]. Вскоре после этого были выявлены активируемые светом белки, которые могут подавлять активность нейронов, и в 2007 году впервые удалось использовать подавляющие опсины для демонстрации управления поведением исследуемого организма [3].
Начиная с 2005 года, когда было придумано само название "оптогенетика" и представлена технология управления, оптогенетика получила широкое применение и рассматривается как одна из самых больших революций в изучении головного мозга и его функций. Крайней границей нейронауки является понимание того, как головной мозг порождает наше поведение, и оптогенетика уже доказала свою беспрецедентную полезность. Активация и замедление опсинов были ориентированы на различные типы нейронов и области головного мозга у грызунов для выявления клеток и областей в центральном головном мозге, отвечающих за страх, тревогу, сон, голод, социальное поведение, обучение, память, агрессию, мотивацию и многое другое. Кроме того, оптогенетика широко используется для понимания того, как изменения в активности головного мозга могут проявляться в расстройствах, таких как депрессия, шизофрения, аутизм, болезнь Паркинсона, эпилепсия и наркомания [4].
Поведение исследуемого организма представляет собой не только оптогенетические манипуляции. О головном мозге можно многое узнать путем объединения оптогенетики с другими технологиями, такими как электрофизиология или диагностические исследования с визуализацией.
Опсины могут быть классифицированы по их эффективности (активация против замедления нервной активности), спектральной чувствительности (пик и интервал длин волн), по средствам переноса ионов через клеточную мембрану (канал или возбуждение), по включению и выключению кинетики, свойствам фототока и другим характеристикам. Большинство опсинов могут быть активированы в широком интервале длин волн (рис.1 и 2). На пике интервала генерируется максимальная активация и фототок. Доступные в настоящее время активируемые светом белки, использующиеся в оптогенетике, имеют длину волны и пик возбуждения в видимой или инфракрасной области спектра [5]. Наиболее часто для активации опсина используют каналродопсин 2 (Channelrhodopsin-2 (ChR2)), который имеет пик активации около 470 нм (синий свет), и опсины, наиболее часто используемые для замедления нейронной активности, – галорходопсины (halorhodopsins, NpHRs), которые оптимально активируются желтым светом (пик активации около 590 нм).
Важно отметить, что в последние годы была разработана обширная флора опсинов для оптогенетики. Когда появилась необходимость одновременной манипуляции поведением исследуемого организма, были, например, разработаны опсины для того, чтобы посменно активировать и замедлять популяции нейронов [6] или для параллельной активации двух различных популяций нейронов в пределах одной области головного мозга [7]. Главное, что показывают приведенные примеры – это возможность с помощью различных длин волн света избирательно активировать один опсин, оставляя другие опсины неизменными. Если два опсина должны быть ориентированы на одну область головного мозга, то при выборе длин волн стимуляции и интенсивности излучения должны быть приняты во внимание спектральное перекрытие и относительные усиления генерируемых фототоков.
Последние достижения в оптогенетике включают в себя разработку опсинов, которые активируются при одной длине волны света и замедляются разными длинами волн – так называемые ступенчатые опсины [5]. Одиночный импульс света одной длины волны активизирует опсин и вызывает постепенное изменение ионных потоков в мембране нейрона, которые могут быть остановлены световым импульсом с другой длиной волны. Чаще всего синий свет используется для активации, а красный для замедления. Однако были использованы и другие комбинации длин волн. Активацию опсинов, чувствительных к красному свету, инженеры исследуют давно [8].
Имплантация волокна в живые ткани требует сложной и высокоточной микрохирургии и часто приводит к повреждению головного мозга. Синие и зеленые длины волн рассеиваются в головном мозге и поглощаются кровью, наконечник волокна должен быть размещен в непосредственной близости от нейронов для исследования эффективности активации опсинов, что затрудняет исследование с малыми и/или глубинными структурами головного мозга. Красный свет проникает в ткани головного мозга более эффективно [8], демонстрируz меньшее рассеяние и поглощение в крови и может даже активировать нейроны через неповрежденный череп. Недавним важным событием в оптогенетике стало создание ингибирующего канального родопсина, чувствительного к синему свету [9]. Этот новый способ позволяет быстрее и в большей степени замедлить оптическое восприятие нервной активности и демонстрирует повышенную чувствительность к свету.
выбор подходящих источников света и волоконно-оптических компонентов для оптогенетических исследований с особым акцентом на поведение грызунов
Использование лазеров и оптики для оптогенетики находится только в зачаточном состоянии. В следующем десятилетии мы можем ожидать от исследователей раскрытия многих внутренних тайн человеческого мозга, а возможно, найти и лекарства, и методы лечения для некоторых из наших самых сложных психиатрических расстройств и заболеваний.
Оптогенетика строится на том, что свет активирует молекулы, называемые опсинами, которые могут находиться в нейронах (рис.3). Светочувствительными нейронами можно управлять с помощью света с очень большой временной и пространственной точностью, соответствующей нормальной обработке информации головным мозгом. Разработка опсинов для оптогенетики – это бурно развивающаяся область, и многие новые и значительно измененные опсины неуклонно становятся доступными для удовлетворения потребностей научно-исследовательских применений, включая те, которые касаются исследования обезьян и человека.
Стремительно развиваясь и имея междисциплинарный характер, оптогенетика представляет собой важную задачу. В частности трудной задачей для многих исследователей является определение точного набора источников света и волоконно-оптических компонентов для их конкретного применения в оптогенетике. Для повышения удобства работы с лазерами, используемыми для оптогенетики, компания Cobolt АВ (Швеция) совместно с лабораториями Мари Карлен и Константиноса Мелетиса в Каролинском институте в Стокгольме работала, серию новых лазерных инструментов для выполнения этой задачи.
Оборудование для оптогенетики
В оптогенетике для манипулирования поведением живых организмов в качестве источников света практически всегда применяются исключительно лазеры. Лазеры генерируют пучок почти параллельных лучей света с очень малой расходимостью, что позволяет эффективно фокусировать его на оптическое волокно – как правило, с диаметром сердцевины от 50 до 300 мкм. Многие эксперименты оптогенетики могут проводиться с использованием одного опсина и с односторонней оптической манипуляцией клетками, представляющими интерес (т. е. в одном полушарии головного мозга).
Были тщательно разработаны три различные конфигурации, которые соответствуют требованиям экспериментов оптогенетики: одномодовый лазер с волоконным манипулятором; два лазера на общей платформе, запускаемые в одно общее волокно манипулятора; или два лазера, находящиеся рядом и запускаемые каждый в своем манипуляторе, состыкованные со сплавленным волокном в комбинации два в одном. Лазеры в установках доступны с регулируемой мощностью 100 мВт на длинах волн 473, 561, 594 и 638 нм, где 561 и 594 нм – это твердотельные лазеры с диодной накачкой (DPSS) с модуляторами или обтюраторами.
К параметрам, которые необходимо учитывать, относится диаметр сердцевины волокна, позволяющий вводить волокно в головной мозг. На рис.4. представлена общедоступная предварительно вживляемая гильза с закрепленным коротким волокном. В ходе эксперимента длинные волокна вставлялись в рукав, который требует идеальной поверхности контакта между коротким и длинным волокном. Кроме того, катетер может быть имплантирован и непрерывные длинные волокна вводятся через катетер в головной мозг в ходе эксперимента. Конец волокна соединен с разъемом, совместимым с разъемом на манипуляторе лазерной установки (например, SMA или FC).
Более сложные эксперименты могут потребовать применения света двух отдельных длин волн, билатеральной (двухсторонней) стимуляции обоих полушарий и свободного передвижения животного. В настоящее время используются две основные методики для доставки двух разных длин волн. В первом случае два световых луча направлены и объединены в одно волокно манипулятора с помощью оптики. Одиночное волокно соединено с лазерной установкой, но при необходимости его можно разделить на два волокна. Второй метод позволяет избежать использования оптики, и каждый из двух световых лучей направлен в отдельное волокно манипулятора. Два волокна затем подключаются к лазерной установке, и если это необходимо, то они могут быть соединены в одно волокно. Для обеспечения свободного передвижения животного и исключения вращения волокна могут быть добавлены вращательные шарниры (рис.3).
Лазеры для оптогенетики
Основная задача для нейробиологов – добиться достаточной освещенности в области головного мозга без подвергания живых тканей повреждениям. Как правило, в заданном месте для успешной манипуляции нейронной активностью требуется интенсивность излучения от 1 до 10 мВт/мм2, но опсины с повышенной светочувствительностью специально спроектированы для уменьшения необходимого количества света. Выбор лазерного источника для оптогенетики является довольно деликатным вопросом. На какие параметры лазера нужно обратить особое внимание?
Во-первых, после того, как был выбран соответствующий опсин, необходимо выбрать лазер с выходной длиной волны, соответствующей чувствительности опсина. В настоящее время наиболее широко используются следующие длины волн: 473, 532, 561, 594 и 638 нм.
Во-вторых, лазер должен обеспечивать достаточную выходную мощность для успешной активации опсина. Таким образом, лазер должен иметь запас мощности для компенсации потерь при передаче сигнала по волокну. Также должна обеспечиваться регулировка мощности излучения, поскольку требования к свету для генерации фототока могут значительно различаться у различных животных, например, из-за разной степени экспрессии опсина. Регулировка мощности лазера также необходима, чтобы избежать повреждения живых тканей из-за избыточной освещенности. Стандартное значение номинальной мощности составляет не менее 100 мВт с полезной мощностью в диапазоне от 20 мВт и до номинального максимума.
Третьим важным параметром является стабильность излучения во времени. Ее поддержание очень важно, так как эксперимент может продолжаться в течение нескольких часов, а стабильность мощности гарантирует, что нежелательные структуры, вызванные обработкой лазерным излучением, не будут созданы из-за вариаций применяемого света. Следовательно, стабильность мощности лазера менее 2% является обязательным условием.
Также должна быть рассмотрена возможность лазерной модуляции. Частота модуляции зависит от физиологических процессов в оптогенетике, т. к. это определяется кинетическими свойствами опсина. Некоторые шаблоны активности в головном мозге длятся порядка секунд, в то время как другие достигают более 100 Гц.
Также очень важно, чтобы времена нарастания и спада светового импульса были короткими, точными и в миллисекундном диапазоне. Не менее важно, чтобы форма импульса и уровень мощности от импульса к импульсу являлись последовательными и повторяющимися в течение всего эксперимента.
Два основных типа лазеров, используемых в оптогенетике – это DPSS-лазеры и лазерные диоды. Оба типа энергоэффективны и имеют компактный дизайн, а также не требуют каких-либо систем охлаждения. Лазерные диоды – экономически наиболее эффективное решение, доступное в синем и красном спектральном диапазоне, хотя еще есть модели с излучением в зеленом, желтом или оранжевом спектре. Они могут быть напрямую модулированы с большой точностью и скоростью, ограниченной только электронной схемой драйвера (рис.6). Мощность лазерных диодов может быть изменена до непосредственной близости к нулю или до максимального номинального значения без разницы в стабильности.
Твердотельные лазеры с диодной накачкой (DPSS-лазеры) представляют собой мощные высокопроизводительные источники излучения, используемые во многих сложных задачах. Они доступны с различным диапазоном длин во всем видимом спектре. Как правило, в оптогенетике используются DPSS-лазеры с длинами волн 532, 561, 594 нм. Лазеры с оптической накачкой будут работать стабильно только в непрерывном режиме и при максимальной номинальной мощности, если детально не разработаны условия, чтобы они функционировали по-другому. Ограничение связано с конструкцией лазеров с оптической накачкой, таких как DPSS-лазеры, так как диодный лазер накачивает кристалл лазера внутри оптического резонатора.
DPSS-лазеры могут работать в широком динамическом диапазоне мощности, но имеют ограничения по возможности модуляции. Тем не менее модулированные DPSS лазеры, как правило, не имеют достаточно хорошей согласованности от импульса к импульсу и стабильности питания во время модуляции для удовлетворения требований задач оптогенетики. Поэтому для использования в оптогенетике DPSS-лазерам нужен встроенный модулятор или быстрый затвор для модуляции света, что позволяет устройствам работать непрерывно и, следовательно, с как можно более высокой стабильностью (рис.7).
Пример эксперимента
В предлагаемом эксперименте зондируют нейроны, отвечающие за управление поведением живой мыши, чтобы избежать попадания в неприятные ситуации. Синий светочувствительный опсин ChR2 предназначен для активации нейронов в одном полушарии головного мозга у мыши, и одно оптическое волокно диаметром 200 мкм имплантируется в кончик волокна, непосредственно прилегающего к нейронам, для манипуляции поведением мыши. Прямоугольная коробка разделяется на две камеры стенкой с открытым проходом для исследования поведения. Программное обеспечение отслеживает движение мыши. Вход мыши в одну из камер запускает активацию синего лазера, который приводит к активации нейронов, представляющих интерес для исследования.
Рис.8 показывает, что применение света приводит к непосредственному выражению аверсивного поведения, т. е. мышь полностью избегает камеру, где активируется лазер. Для подтверждения факта, что аверсивное поведение вызвано именно активацией нейронов, а не внешними факторами, лазер впоследствии срабатывает в другой камере. В результате мышь теперь избегает и этой камеры.
Литература
1. Crick F.H. Thinking about the brain. – Sci Am, 1979, v. 241, p. 219–232.
2. Nagel G. et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. – Curr Biol, 2005, p. 2279–2284.
3. Zhang F. et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. – Nature, 2007, v. 446, p. 633–639.
4. Tye K.M. and Deisseroth K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. – Nat. Rev. Neurosci, 2012, v. 13, p. 251–266.
5. Yizhar O. et al. Optogenetics in neural systems. – Neuron, 2011, v. 71, p. 9–34.
6. Zhang F. et al. Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems. – Nat. Rev. Neuroscitnce, 2007, v. 8, p. 577–581.
7. Yizhar O. et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. – Nature, 2011, v. 477, p. 171–178.
8. Lin J.Y. et al. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. – Nat. Neurosci, 2013, v. 16, p. 1499–1508.
9. Berndt A. et al. Structure-guided transformation of channelrhodopsin into a light-activated chloride channel. – Science, 2014, v. 344, p. 420–424.
10. Mattis J. et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. – Nat Methods, 2012, v. 9, p. 159–172.
11. Klapoetke N.C. et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. – Nat. Methods, 2014, v. 11, p. 338–346.
12. Chuong A.S. et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. – Nat Neurosci, 2014, v. 17, p. 1123–1129.
[1] Статья и перевод на английский язык предоставлены компанией ЗАО "НТК"АЗИМУТ ФОТОНИКС"
История концепции оптогенетики восходит к 1970-м годам, когда доктор Фрэнсис Крик, один из открывателей ДНК, описал словами, что в неврологии необходим метод управления нервными клетками одного типа, оставляя другие клетки не затронутыми, чтобы понять, как работает головной мозг [1]. Крик позже предположил, что таким средством управления нейронами извне будет свет. Свет позволит синхронизовать с произвольной временной точностью соответствующие сигналы, обрабатываемые мозгом.
Независимо от исследований Фрэнсиса Крика биологами того времени были выявлены микроорганизмы, способные регулировать поток ионов (электрический заряд) через их мембраны с помощью светочувствительных белков (опсины). Основываясь на том, что активность нейронов регулируется потоком ионов через плазматическую мембрану, ученые в конце 1990-х годов начали исследовать применение светочувствительных белков для контроля нейронов, но исследователи не признавали опсины как пригодные для неврологии до 2000-х годов. Совместные усилия нескольких исследовательских групп принесли свои плоды только в 2005 году. Тогда впервые свет и однокомпонентный светочувствительный ионный канал были использованы для активации нейронов, что приводило к изменению поведения исследуемого животного [2]. Вскоре после этого были выявлены активируемые светом белки, которые могут подавлять активность нейронов, и в 2007 году впервые удалось использовать подавляющие опсины для демонстрации управления поведением исследуемого организма [3].
Начиная с 2005 года, когда было придумано само название "оптогенетика" и представлена технология управления, оптогенетика получила широкое применение и рассматривается как одна из самых больших революций в изучении головного мозга и его функций. Крайней границей нейронауки является понимание того, как головной мозг порождает наше поведение, и оптогенетика уже доказала свою беспрецедентную полезность. Активация и замедление опсинов были ориентированы на различные типы нейронов и области головного мозга у грызунов для выявления клеток и областей в центральном головном мозге, отвечающих за страх, тревогу, сон, голод, социальное поведение, обучение, память, агрессию, мотивацию и многое другое. Кроме того, оптогенетика широко используется для понимания того, как изменения в активности головного мозга могут проявляться в расстройствах, таких как депрессия, шизофрения, аутизм, болезнь Паркинсона, эпилепсия и наркомания [4].
Поведение исследуемого организма представляет собой не только оптогенетические манипуляции. О головном мозге можно многое узнать путем объединения оптогенетики с другими технологиями, такими как электрофизиология или диагностические исследования с визуализацией.
Опсины могут быть классифицированы по их эффективности (активация против замедления нервной активности), спектральной чувствительности (пик и интервал длин волн), по средствам переноса ионов через клеточную мембрану (канал или возбуждение), по включению и выключению кинетики, свойствам фототока и другим характеристикам. Большинство опсинов могут быть активированы в широком интервале длин волн (рис.1 и 2). На пике интервала генерируется максимальная активация и фототок. Доступные в настоящее время активируемые светом белки, использующиеся в оптогенетике, имеют длину волны и пик возбуждения в видимой или инфракрасной области спектра [5]. Наиболее часто для активации опсина используют каналродопсин 2 (Channelrhodopsin-2 (ChR2)), который имеет пик активации около 470 нм (синий свет), и опсины, наиболее часто используемые для замедления нейронной активности, – галорходопсины (halorhodopsins, NpHRs), которые оптимально активируются желтым светом (пик активации около 590 нм).
Важно отметить, что в последние годы была разработана обширная флора опсинов для оптогенетики. Когда появилась необходимость одновременной манипуляции поведением исследуемого организма, были, например, разработаны опсины для того, чтобы посменно активировать и замедлять популяции нейронов [6] или для параллельной активации двух различных популяций нейронов в пределах одной области головного мозга [7]. Главное, что показывают приведенные примеры – это возможность с помощью различных длин волн света избирательно активировать один опсин, оставляя другие опсины неизменными. Если два опсина должны быть ориентированы на одну область головного мозга, то при выборе длин волн стимуляции и интенсивности излучения должны быть приняты во внимание спектральное перекрытие и относительные усиления генерируемых фототоков.
Последние достижения в оптогенетике включают в себя разработку опсинов, которые активируются при одной длине волны света и замедляются разными длинами волн – так называемые ступенчатые опсины [5]. Одиночный импульс света одной длины волны активизирует опсин и вызывает постепенное изменение ионных потоков в мембране нейрона, которые могут быть остановлены световым импульсом с другой длиной волны. Чаще всего синий свет используется для активации, а красный для замедления. Однако были использованы и другие комбинации длин волн. Активацию опсинов, чувствительных к красному свету, инженеры исследуют давно [8].
Имплантация волокна в живые ткани требует сложной и высокоточной микрохирургии и часто приводит к повреждению головного мозга. Синие и зеленые длины волн рассеиваются в головном мозге и поглощаются кровью, наконечник волокна должен быть размещен в непосредственной близости от нейронов для исследования эффективности активации опсинов, что затрудняет исследование с малыми и/или глубинными структурами головного мозга. Красный свет проникает в ткани головного мозга более эффективно [8], демонстрируz меньшее рассеяние и поглощение в крови и может даже активировать нейроны через неповрежденный череп. Недавним важным событием в оптогенетике стало создание ингибирующего канального родопсина, чувствительного к синему свету [9]. Этот новый способ позволяет быстрее и в большей степени замедлить оптическое восприятие нервной активности и демонстрирует повышенную чувствительность к свету.
выбор подходящих источников света и волоконно-оптических компонентов для оптогенетических исследований с особым акцентом на поведение грызунов
Использование лазеров и оптики для оптогенетики находится только в зачаточном состоянии. В следующем десятилетии мы можем ожидать от исследователей раскрытия многих внутренних тайн человеческого мозга, а возможно, найти и лекарства, и методы лечения для некоторых из наших самых сложных психиатрических расстройств и заболеваний.
Оптогенетика строится на том, что свет активирует молекулы, называемые опсинами, которые могут находиться в нейронах (рис.3). Светочувствительными нейронами можно управлять с помощью света с очень большой временной и пространственной точностью, соответствующей нормальной обработке информации головным мозгом. Разработка опсинов для оптогенетики – это бурно развивающаяся область, и многие новые и значительно измененные опсины неуклонно становятся доступными для удовлетворения потребностей научно-исследовательских применений, включая те, которые касаются исследования обезьян и человека.
Стремительно развиваясь и имея междисциплинарный характер, оптогенетика представляет собой важную задачу. В частности трудной задачей для многих исследователей является определение точного набора источников света и волоконно-оптических компонентов для их конкретного применения в оптогенетике. Для повышения удобства работы с лазерами, используемыми для оптогенетики, компания Cobolt АВ (Швеция) совместно с лабораториями Мари Карлен и Константиноса Мелетиса в Каролинском институте в Стокгольме работала, серию новых лазерных инструментов для выполнения этой задачи.
Оборудование для оптогенетики
В оптогенетике для манипулирования поведением живых организмов в качестве источников света практически всегда применяются исключительно лазеры. Лазеры генерируют пучок почти параллельных лучей света с очень малой расходимостью, что позволяет эффективно фокусировать его на оптическое волокно – как правило, с диаметром сердцевины от 50 до 300 мкм. Многие эксперименты оптогенетики могут проводиться с использованием одного опсина и с односторонней оптической манипуляцией клетками, представляющими интерес (т. е. в одном полушарии головного мозга).
Были тщательно разработаны три различные конфигурации, которые соответствуют требованиям экспериментов оптогенетики: одномодовый лазер с волоконным манипулятором; два лазера на общей платформе, запускаемые в одно общее волокно манипулятора; или два лазера, находящиеся рядом и запускаемые каждый в своем манипуляторе, состыкованные со сплавленным волокном в комбинации два в одном. Лазеры в установках доступны с регулируемой мощностью 100 мВт на длинах волн 473, 561, 594 и 638 нм, где 561 и 594 нм – это твердотельные лазеры с диодной накачкой (DPSS) с модуляторами или обтюраторами.
К параметрам, которые необходимо учитывать, относится диаметр сердцевины волокна, позволяющий вводить волокно в головной мозг. На рис.4. представлена общедоступная предварительно вживляемая гильза с закрепленным коротким волокном. В ходе эксперимента длинные волокна вставлялись в рукав, который требует идеальной поверхности контакта между коротким и длинным волокном. Кроме того, катетер может быть имплантирован и непрерывные длинные волокна вводятся через катетер в головной мозг в ходе эксперимента. Конец волокна соединен с разъемом, совместимым с разъемом на манипуляторе лазерной установки (например, SMA или FC).
Более сложные эксперименты могут потребовать применения света двух отдельных длин волн, билатеральной (двухсторонней) стимуляции обоих полушарий и свободного передвижения животного. В настоящее время используются две основные методики для доставки двух разных длин волн. В первом случае два световых луча направлены и объединены в одно волокно манипулятора с помощью оптики. Одиночное волокно соединено с лазерной установкой, но при необходимости его можно разделить на два волокна. Второй метод позволяет избежать использования оптики, и каждый из двух световых лучей направлен в отдельное волокно манипулятора. Два волокна затем подключаются к лазерной установке, и если это необходимо, то они могут быть соединены в одно волокно. Для обеспечения свободного передвижения животного и исключения вращения волокна могут быть добавлены вращательные шарниры (рис.3).
Лазеры для оптогенетики
Основная задача для нейробиологов – добиться достаточной освещенности в области головного мозга без подвергания живых тканей повреждениям. Как правило, в заданном месте для успешной манипуляции нейронной активностью требуется интенсивность излучения от 1 до 10 мВт/мм2, но опсины с повышенной светочувствительностью специально спроектированы для уменьшения необходимого количества света. Выбор лазерного источника для оптогенетики является довольно деликатным вопросом. На какие параметры лазера нужно обратить особое внимание?
Во-первых, после того, как был выбран соответствующий опсин, необходимо выбрать лазер с выходной длиной волны, соответствующей чувствительности опсина. В настоящее время наиболее широко используются следующие длины волн: 473, 532, 561, 594 и 638 нм.
Во-вторых, лазер должен обеспечивать достаточную выходную мощность для успешной активации опсина. Таким образом, лазер должен иметь запас мощности для компенсации потерь при передаче сигнала по волокну. Также должна обеспечиваться регулировка мощности излучения, поскольку требования к свету для генерации фототока могут значительно различаться у различных животных, например, из-за разной степени экспрессии опсина. Регулировка мощности лазера также необходима, чтобы избежать повреждения живых тканей из-за избыточной освещенности. Стандартное значение номинальной мощности составляет не менее 100 мВт с полезной мощностью в диапазоне от 20 мВт и до номинального максимума.
Третьим важным параметром является стабильность излучения во времени. Ее поддержание очень важно, так как эксперимент может продолжаться в течение нескольких часов, а стабильность мощности гарантирует, что нежелательные структуры, вызванные обработкой лазерным излучением, не будут созданы из-за вариаций применяемого света. Следовательно, стабильность мощности лазера менее 2% является обязательным условием.
Также должна быть рассмотрена возможность лазерной модуляции. Частота модуляции зависит от физиологических процессов в оптогенетике, т. к. это определяется кинетическими свойствами опсина. Некоторые шаблоны активности в головном мозге длятся порядка секунд, в то время как другие достигают более 100 Гц.
Также очень важно, чтобы времена нарастания и спада светового импульса были короткими, точными и в миллисекундном диапазоне. Не менее важно, чтобы форма импульса и уровень мощности от импульса к импульсу являлись последовательными и повторяющимися в течение всего эксперимента.
Два основных типа лазеров, используемых в оптогенетике – это DPSS-лазеры и лазерные диоды. Оба типа энергоэффективны и имеют компактный дизайн, а также не требуют каких-либо систем охлаждения. Лазерные диоды – экономически наиболее эффективное решение, доступное в синем и красном спектральном диапазоне, хотя еще есть модели с излучением в зеленом, желтом или оранжевом спектре. Они могут быть напрямую модулированы с большой точностью и скоростью, ограниченной только электронной схемой драйвера (рис.6). Мощность лазерных диодов может быть изменена до непосредственной близости к нулю или до максимального номинального значения без разницы в стабильности.
Твердотельные лазеры с диодной накачкой (DPSS-лазеры) представляют собой мощные высокопроизводительные источники излучения, используемые во многих сложных задачах. Они доступны с различным диапазоном длин во всем видимом спектре. Как правило, в оптогенетике используются DPSS-лазеры с длинами волн 532, 561, 594 нм. Лазеры с оптической накачкой будут работать стабильно только в непрерывном режиме и при максимальной номинальной мощности, если детально не разработаны условия, чтобы они функционировали по-другому. Ограничение связано с конструкцией лазеров с оптической накачкой, таких как DPSS-лазеры, так как диодный лазер накачивает кристалл лазера внутри оптического резонатора.
DPSS-лазеры могут работать в широком динамическом диапазоне мощности, но имеют ограничения по возможности модуляции. Тем не менее модулированные DPSS лазеры, как правило, не имеют достаточно хорошей согласованности от импульса к импульсу и стабильности питания во время модуляции для удовлетворения требований задач оптогенетики. Поэтому для использования в оптогенетике DPSS-лазерам нужен встроенный модулятор или быстрый затвор для модуляции света, что позволяет устройствам работать непрерывно и, следовательно, с как можно более высокой стабильностью (рис.7).
Пример эксперимента
В предлагаемом эксперименте зондируют нейроны, отвечающие за управление поведением живой мыши, чтобы избежать попадания в неприятные ситуации. Синий светочувствительный опсин ChR2 предназначен для активации нейронов в одном полушарии головного мозга у мыши, и одно оптическое волокно диаметром 200 мкм имплантируется в кончик волокна, непосредственно прилегающего к нейронам, для манипуляции поведением мыши. Прямоугольная коробка разделяется на две камеры стенкой с открытым проходом для исследования поведения. Программное обеспечение отслеживает движение мыши. Вход мыши в одну из камер запускает активацию синего лазера, который приводит к активации нейронов, представляющих интерес для исследования.
Рис.8 показывает, что применение света приводит к непосредственному выражению аверсивного поведения, т. е. мышь полностью избегает камеру, где активируется лазер. Для подтверждения факта, что аверсивное поведение вызвано именно активацией нейронов, а не внешними факторами, лазер впоследствии срабатывает в другой камере. В результате мышь теперь избегает и этой камеры.
Литература
1. Crick F.H. Thinking about the brain. – Sci Am, 1979, v. 241, p. 219–232.
2. Nagel G. et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. – Curr Biol, 2005, p. 2279–2284.
3. Zhang F. et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. – Nature, 2007, v. 446, p. 633–639.
4. Tye K.M. and Deisseroth K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. – Nat. Rev. Neurosci, 2012, v. 13, p. 251–266.
5. Yizhar O. et al. Optogenetics in neural systems. – Neuron, 2011, v. 71, p. 9–34.
6. Zhang F. et al. Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems. – Nat. Rev. Neuroscitnce, 2007, v. 8, p. 577–581.
7. Yizhar O. et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. – Nature, 2011, v. 477, p. 171–178.
8. Lin J.Y. et al. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. – Nat. Neurosci, 2013, v. 16, p. 1499–1508.
9. Berndt A. et al. Structure-guided transformation of channelrhodopsin into a light-activated chloride channel. – Science, 2014, v. 344, p. 420–424.
10. Mattis J. et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. – Nat Methods, 2012, v. 9, p. 159–172.
11. Klapoetke N.C. et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. – Nat. Methods, 2014, v. 11, p. 338–346.
12. Chuong A.S. et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. – Nat Neurosci, 2014, v. 17, p. 1123–1129.
[1] Статья и перевод на английский язык предоставлены компанией ЗАО "НТК"АЗИМУТ ФОТОНИКС"
Отзывы читателей
