eng
Выпуск #6/2013
Л. Кестнер, П. Липп, Д. Гегерфельт, Х.Карлсон, Е.Илли, Дж.Хельстрём
Флюоресцентная микроскопия живых клеток с использованием новых 515-нм DPSS-лазеров
Флюоресцентная микроскопия живых клеток с использованием новых 515-нм DPSS-лазеров
Просмотры: 4885
Новые твердотельные лазеры с диодной накачкой (Diode-Pumped Solid-State – DPSS), излучающие на длине волны 515 нм, заполняют серьезный пробел в линейке компактных лазеров. Новая технология будет востребована в биологии при исследовании живых клеток, в использовании конфокальной, FRET (флюоресцентный резонансный перенос энергии)-, FRAP (восстановление флюоресценции после фотовыжигания)- и TIRF (полная внутренняя микроскопия флюоресценции)-микроскопии, а также проточной цитометрии.
Теги: confocal microscopy dpss lasers dpss-лазеры конфокальная микроскопия flow cytometry frap- frap and tirf microscopy fret fret- solid-state lasers tirf- микроскопия проточная цитометрия твердотельные лазеры
В последние годы в качестве источников возбуждения в биоаналитической измерительной технике вместо газовых лазеров все чаще используются ПТЛ. По сравнению с газовыми лазерами DPSS-лазеры компактны, характеризуются низким тепловыделением, потребляют меньше мощности, при их работе отсутствуют вибрации или шум, они обладают высокой стабильностью лазерного излучения, а также бóльшим временем жизни. На данный момент доступны лазерные диоды, излучающие в УФ-, темно-синей (375, 405, 445, 488 нм), а также в красной и ИК (635, 780, 830 нм)-областях спектра.
Однако пока не существует лазерных диодов, излучающих в желто-зеленом диапазоне видимой области спектра, но соответствующие разработки уже начатлись (например, [1,2]). Поэтому на данный момент для получения лазерного излучения в этом диапазоне используются DPSS-лазеры, работающие на типовых длинах волн – 488, 532 и 561 нм. Однако до настоящего времени не существовало лазера, излучающего на длине волны ~515 нм; на этой волне могут быть возбуждены многие флюорофоры (фрагменты молекул, придающие им флюоресцентные свойства, рис.1). Из-за отсутствия альтернатив ранее использовались аргоновый и аргоно-криптоновый лазеры, несмотря на все присущие им недостатки ионных лазеров. Далее рассмотрим техническое описание и применения инновационного DPSS-лазера, который, работая на длине волны 515 нм, способен заменить аргоновый лазер.
Технический концепт
Типичные широкоапертурные лазерные диоды с торцевым излучением применяют в качестве источников накачки в новых DPSS-лазерах. Активная среда в таком лазере представляет собой легированный иттербием (Yb) лазерный кристалл, излучающий на длине волны 1030 нм. Частота удваивается с помощью эффективного внутрирезонаторного частотного преобразования [3] в кристалле калий-титанил-фосфата с регулярной доменной структурой (рис.2). Спектральные фильтры позволяют лазеру работать в режиме одной продольной моды (ширина полосы частот менее 1 МГц), что обеспечивает очень низкий уровень шума и стабильность выходной мощности в широком температурном диапазоне (рис.3). Использование вогнутого зеркала позволяет получить лазерное пятно с высоким качеством поперечной структуры при всех выходных мощностях. Лазерный резонатор заключен в маленький герметично закрытый блок, который обеспечивает высокую стойкость к вибрациям, ударам, изменениям температуры и влажности окружающей среды. Такая концепция лазера позволяет конструировать лазеры с различной выходной мощностью. Помимо изначально разработанного 25-мВт лазера на данный момент стали доступны 50-мВт лазеры для более мощных приложений, таких как FRAP (восстановление флюоресценции после обесцвечивания), высокоскоростная сортировка клеток, плашечный анализ и конфокальная микроскопия на основе вращающегося диска (диска Нипкова).
Приложения
В последнее время во всем новом и обновляемом биоаналитическом оборудовании лазерные диоды и DPSS-лазеры оказались более предпочтительны, чем газовые лазеры. Это коснулось таких методов, как проточная цитометрия, ДНК-секвенирование; методов микроскопии – конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, микроскопии полной внутренней флюоресценции (TIRF) и флюоресцентной корреляционной спектроскопиия (FCS). Поглощающие пики многих флюоресцирующих красителей флюорофоров расположены близко к рабочей длине волны аргон-ионного лазера (рис.1). В их ряду – пики таких антител, как Alexa Fluor 514 и Oregon Green 514, пик желтого флюоресцентного белка eYFP, флюоресцентные белковые гибридные белки, как например Premo Cameleon, а также пики, связанные с ферстеровским переносом энергии (FRET) между голубым(CFP) и желтым(YFP) флюоресцентными белками. В этом же диапазоне расположены пики других важных веществ, в частности пики поглощения 6-JOE, используемого для автоматического ДНК-секвенирования. Рядом – пик, близкий к длине волны SYBR Safe-красителя (λ = 515 нм). Это вещество способно заменить токсичный бромистый этидий (EtBr) в задачах визуализации ДНК. Следом за ними идет пик FlAsH – малоинвазивной тетрацистеиновой белковой бирки, белковый мостик которой содержит всего один пептид, состоящий из шести аминокислот.
Для наблюдения всех перечисленных веществ требуется лазер, работающий на длине волны ~514,5 нм. И производители соответствующего оборудования вынуждены снабжать свои аналитические устройства громоздкими аргон-ионными лазерами, часто вынесенными в отдельные блоки и соединенные с основной установкой посредством оптоволокон. Хотя, несомненно, все остальные возбуждающие лазерные линии могут быть получены с помощью компактных твердотельных лазеров, интегрированных в корпус измерительного оборудования. Новый 515-нм лазер Cobolt Fandango способен решить эту проблему. Ниже мы представим свежие экспериментальные результаты по наблюдению за живыми клетками, полученные в Институте молекулярной клеточной биологии Саарландского университета (Германия) при помощи конфокальной микроскопии с использованием этого лазера.
Визуализация живых клеток
В новейших биомедицинских исследованиях растет интерес к высокоразрешающей флюоресцентной микроскопии, используемой для изучения живых клеток. Этот метод применяют как для структурных и морфологических исследований, так и для изучения динамических процессов, вплоть до визуализации биохимических реакций. Некоторые из этих реакций, особенно те, что протекают в мозге и в сердечных мышцах, настолько быстротечны, что требуемая частота кадров достигает сотни изображений в секунду. Традиционные методы конфокальной микроскопии обычно не способны обеспечить такие скорости съемок. Поэтому для этих целей используют многоволновые методы (когда одновременно множество параллельных лазерных лучей попадают на цель), а также конфокальную микроскопию щелевой развертки. На данный момент для таких исследований наиболее популярными у приборостроителей являются устройства на основе тандемного сканера с использованием диска Нипкова (рис.4). Обычно в таких приборах используется сканирующая головка, разработанная корпорацией Yokogawa. Другими примерами реализации многолучевых методов являются конфокальный микроскоп развертки поля (Nikon, Japan) и Kilobeam Array Scanner (VisiTech, UK). Так как в таких приборах лазерный пучок расщепляется на несколько лучей, выходная мощность лазера должна составлять не менее 20 мВт. Для испытания лазера Cobolt Fandango 515 нм инструмент был непосредственно установлен в многолучевой конфокальный микроскоп VT-infinity (VisiTech, UK), настроенный для наблюдения за живыми клетками. На рис.5 изображена митохондриальная система в культуре клеток почек африканской зеленой мартышки (COS-1). Флюоресценция исходит от желтого флюоресцентного белка eYFP, который был включен в митохондриальную последовательность из цитохром с-оксидаз, а поэтому позволяет изучать исключительно только митохондрию. Понятно (см. рис.5), что митохондрия, вопреки распространенным иллюстрациям в учебниках, не всегда яйцевидна, а может принимать сложные формы.
В качестве другого примера (рис.6) показано динамическое перемещение протеинкиназы Cα (исследованное с помощью соединения ее с eYFP) после введения аденозинтрифосфата (АТФ). Здесь также материнскими клетками, содержащими комплексный белок, служили COS-1 клетки. Интерпретация и актульность этого процесса выходит за рамки данной статьи (дополнительная информация может быть найдена, например, в [4,5]). Тем не менее, из приведенных примеров ясно, что динамические процессы в живых клетках теперь могут быть успешно исследованы с помощью аппаратуры с применением DPSS-лазеров, подходящих для исследований с помощью eYFP.
Перспективы
В качестве более перспективного применения DPSS-лазера (по сравнению с представленными примерами подкрашивания с помощью YFP), можно провести количественный анализ с использованием наиболее распространенного на сегодняшний день голубого флюоресцентного белка CFP. Это актуально для внутримолекулярной FRET-микроскопии с использованием индикатора Cameleon (например, Premo-Camilion, см. рис.1) или киназ, а также для межмолекулярной FRET-микроскопии для детектирования рецепторных связей и других молекулярных взаимодействий.
Литература
www.darpa.mil/MTO/Programs/vigil. DARPA (Defense Advanced Research Projects Agency, USA) project Visible InGaN Injection Lasers (VIGIL).
http://ieeexplore.ieee.org/xpls/abs_all.jsp?arnumber=4097109. Wallerand J.-P. A frequency doubled amplified fiber laser for molecular iodine spectroscopy near 515 nm, Proceedings. Conference on Precision Electromagnetic Measurements Digest. – London,June 2004.
Karlsson H., Laurell F. Electricfield poling of flux grown KTiOPO4. – Appl. Phys. Lett., 1997, v.71 (24), p.3474.
Reither G., Schaefer M., Lipp P. PKCα: a versatile key for decoding the cellular calcium toolkit, Journal of Cell Biology, 2006,v.174, p.521– 533.
Kaestner L., Lipp P. Towards Imaging the Dynamics of Protein Signalling.– In: S.L. Shorte, F. Frischknecht (Eds.).– Imaging Cellular and Molecular Biological Function, 2007. – Springer, p. 283–306
Однако пока не существует лазерных диодов, излучающих в желто-зеленом диапазоне видимой области спектра, но соответствующие разработки уже начатлись (например, [1,2]). Поэтому на данный момент для получения лазерного излучения в этом диапазоне используются DPSS-лазеры, работающие на типовых длинах волн – 488, 532 и 561 нм. Однако до настоящего времени не существовало лазера, излучающего на длине волны ~515 нм; на этой волне могут быть возбуждены многие флюорофоры (фрагменты молекул, придающие им флюоресцентные свойства, рис.1). Из-за отсутствия альтернатив ранее использовались аргоновый и аргоно-криптоновый лазеры, несмотря на все присущие им недостатки ионных лазеров. Далее рассмотрим техническое описание и применения инновационного DPSS-лазера, который, работая на длине волны 515 нм, способен заменить аргоновый лазер.
Технический концепт
Типичные широкоапертурные лазерные диоды с торцевым излучением применяют в качестве источников накачки в новых DPSS-лазерах. Активная среда в таком лазере представляет собой легированный иттербием (Yb) лазерный кристалл, излучающий на длине волны 1030 нм. Частота удваивается с помощью эффективного внутрирезонаторного частотного преобразования [3] в кристалле калий-титанил-фосфата с регулярной доменной структурой (рис.2). Спектральные фильтры позволяют лазеру работать в режиме одной продольной моды (ширина полосы частот менее 1 МГц), что обеспечивает очень низкий уровень шума и стабильность выходной мощности в широком температурном диапазоне (рис.3). Использование вогнутого зеркала позволяет получить лазерное пятно с высоким качеством поперечной структуры при всех выходных мощностях. Лазерный резонатор заключен в маленький герметично закрытый блок, который обеспечивает высокую стойкость к вибрациям, ударам, изменениям температуры и влажности окружающей среды. Такая концепция лазера позволяет конструировать лазеры с различной выходной мощностью. Помимо изначально разработанного 25-мВт лазера на данный момент стали доступны 50-мВт лазеры для более мощных приложений, таких как FRAP (восстановление флюоресценции после обесцвечивания), высокоскоростная сортировка клеток, плашечный анализ и конфокальная микроскопия на основе вращающегося диска (диска Нипкова).
Приложения
В последнее время во всем новом и обновляемом биоаналитическом оборудовании лазерные диоды и DPSS-лазеры оказались более предпочтительны, чем газовые лазеры. Это коснулось таких методов, как проточная цитометрия, ДНК-секвенирование; методов микроскопии – конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, микроскопии полной внутренней флюоресценции (TIRF) и флюоресцентной корреляционной спектроскопиия (FCS). Поглощающие пики многих флюоресцирующих красителей флюорофоров расположены близко к рабочей длине волны аргон-ионного лазера (рис.1). В их ряду – пики таких антител, как Alexa Fluor 514 и Oregon Green 514, пик желтого флюоресцентного белка eYFP, флюоресцентные белковые гибридные белки, как например Premo Cameleon, а также пики, связанные с ферстеровским переносом энергии (FRET) между голубым(CFP) и желтым(YFP) флюоресцентными белками. В этом же диапазоне расположены пики других важных веществ, в частности пики поглощения 6-JOE, используемого для автоматического ДНК-секвенирования. Рядом – пик, близкий к длине волны SYBR Safe-красителя (λ = 515 нм). Это вещество способно заменить токсичный бромистый этидий (EtBr) в задачах визуализации ДНК. Следом за ними идет пик FlAsH – малоинвазивной тетрацистеиновой белковой бирки, белковый мостик которой содержит всего один пептид, состоящий из шести аминокислот.
Для наблюдения всех перечисленных веществ требуется лазер, работающий на длине волны ~514,5 нм. И производители соответствующего оборудования вынуждены снабжать свои аналитические устройства громоздкими аргон-ионными лазерами, часто вынесенными в отдельные блоки и соединенные с основной установкой посредством оптоволокон. Хотя, несомненно, все остальные возбуждающие лазерные линии могут быть получены с помощью компактных твердотельных лазеров, интегрированных в корпус измерительного оборудования. Новый 515-нм лазер Cobolt Fandango способен решить эту проблему. Ниже мы представим свежие экспериментальные результаты по наблюдению за живыми клетками, полученные в Институте молекулярной клеточной биологии Саарландского университета (Германия) при помощи конфокальной микроскопии с использованием этого лазера.
Визуализация живых клеток
В новейших биомедицинских исследованиях растет интерес к высокоразрешающей флюоресцентной микроскопии, используемой для изучения живых клеток. Этот метод применяют как для структурных и морфологических исследований, так и для изучения динамических процессов, вплоть до визуализации биохимических реакций. Некоторые из этих реакций, особенно те, что протекают в мозге и в сердечных мышцах, настолько быстротечны, что требуемая частота кадров достигает сотни изображений в секунду. Традиционные методы конфокальной микроскопии обычно не способны обеспечить такие скорости съемок. Поэтому для этих целей используют многоволновые методы (когда одновременно множество параллельных лазерных лучей попадают на цель), а также конфокальную микроскопию щелевой развертки. На данный момент для таких исследований наиболее популярными у приборостроителей являются устройства на основе тандемного сканера с использованием диска Нипкова (рис.4). Обычно в таких приборах используется сканирующая головка, разработанная корпорацией Yokogawa. Другими примерами реализации многолучевых методов являются конфокальный микроскоп развертки поля (Nikon, Japan) и Kilobeam Array Scanner (VisiTech, UK). Так как в таких приборах лазерный пучок расщепляется на несколько лучей, выходная мощность лазера должна составлять не менее 20 мВт. Для испытания лазера Cobolt Fandango 515 нм инструмент был непосредственно установлен в многолучевой конфокальный микроскоп VT-infinity (VisiTech, UK), настроенный для наблюдения за живыми клетками. На рис.5 изображена митохондриальная система в культуре клеток почек африканской зеленой мартышки (COS-1). Флюоресценция исходит от желтого флюоресцентного белка eYFP, который был включен в митохондриальную последовательность из цитохром с-оксидаз, а поэтому позволяет изучать исключительно только митохондрию. Понятно (см. рис.5), что митохондрия, вопреки распространенным иллюстрациям в учебниках, не всегда яйцевидна, а может принимать сложные формы.
В качестве другого примера (рис.6) показано динамическое перемещение протеинкиназы Cα (исследованное с помощью соединения ее с eYFP) после введения аденозинтрифосфата (АТФ). Здесь также материнскими клетками, содержащими комплексный белок, служили COS-1 клетки. Интерпретация и актульность этого процесса выходит за рамки данной статьи (дополнительная информация может быть найдена, например, в [4,5]). Тем не менее, из приведенных примеров ясно, что динамические процессы в живых клетках теперь могут быть успешно исследованы с помощью аппаратуры с применением DPSS-лазеров, подходящих для исследований с помощью eYFP.
Перспективы
В качестве более перспективного применения DPSS-лазера (по сравнению с представленными примерами подкрашивания с помощью YFP), можно провести количественный анализ с использованием наиболее распространенного на сегодняшний день голубого флюоресцентного белка CFP. Это актуально для внутримолекулярной FRET-микроскопии с использованием индикатора Cameleon (например, Premo-Camilion, см. рис.1) или киназ, а также для межмолекулярной FRET-микроскопии для детектирования рецепторных связей и других молекулярных взаимодействий.
Литература
www.darpa.mil/MTO/Programs/vigil. DARPA (Defense Advanced Research Projects Agency, USA) project Visible InGaN Injection Lasers (VIGIL).
http://ieeexplore.ieee.org/xpls/abs_all.jsp?arnumber=4097109. Wallerand J.-P. A frequency doubled amplified fiber laser for molecular iodine spectroscopy near 515 nm, Proceedings. Conference on Precision Electromagnetic Measurements Digest. – London,June 2004.
Karlsson H., Laurell F. Electricfield poling of flux grown KTiOPO4. – Appl. Phys. Lett., 1997, v.71 (24), p.3474.
Reither G., Schaefer M., Lipp P. PKCα: a versatile key for decoding the cellular calcium toolkit, Journal of Cell Biology, 2006,v.174, p.521– 533.
Kaestner L., Lipp P. Towards Imaging the Dynamics of Protein Signalling.– In: S.L. Shorte, F. Frischknecht (Eds.).– Imaging Cellular and Molecular Biological Function, 2007. – Springer, p. 283–306
Отзывы читателей
