eng
Выпуск #2/2013
А. Будаговский
Обладает ли низкоинтенсивное лазерное излучение мутагенным действием?
Обладает ли низкоинтенсивное лазерное излучение мутагенным действием?
Просмотры: 3342
С каждым годом среда обитания человека становится все более агрессивной. В результате биосфера подвергается воздействию низкоинтенсивного когерентного излучения. Обладает ли такое излучение мутагенным действием, и если да, то каковы могут быть экологические последствия? На этот счет существуют прямо противоположенные точки зрения, которые активно обсуждались на последних конференциях по применению лазеров. Учитывая не только научную, но и социальную значимость вопроса, целесообразно провести его широкое обсуждение. Настоящую статью можно считать приглашением к дискуссии на страницах журнала "Фотоника".
Теги: human environment low-intensity coherent radiation низкоинтенсивное когерентное излучение среда обитания человека
История вопроса уходит в 60-е годы прошлого века, когда было установлено, что кратковременное (от единиц секунд до десятков минут) воздействие генерируемого лазерами низкоинтенсивного когерентного излучения (НКИ) способно повышать функциональную активность растительных и животных организмов. Стимуляционный эффект был хорошо выражен и мог долгое время сохраняться в пострадиационный период. Проиллюстрируем это на двух примерах, имеющих практическое значение.
Облученные черенки растений не только укореняются лучше контрольных, но и превосходят их по росту и развитию в течение всего периода вегетации (рис.1) [1]. Иммунная реакция обработанных лазерным светом плодов выше, чем у не обработанных, о чем можно судить по величине потерь товарной продукции от гнилей (рис.2). В процессе хранения различия с контролем не нивелируются, а, наоборот, становился более заметным (рис.3). Важно отметить, что физиологическая активность клеток плодов возрастает лишь при достаточно большом объеме когерентности действующего поля [2]. Низкокогерентное излучение активизирует только мелкие клетки патогена, усиливая поражение яблок.
Исследования, проведенные в нашей стране и за рубежом, показали, что стимуляционный эффект НКИ может не только длительное время сохраняться, но и передаваться следующим поколениям [3–13]. При этом наблюдали целый ряд характерных для мутагенеза черт: изменение количественных и качественных признаков, их сохранение при вегетативном или генеративном размножении растений, образование хромосомных аберраций, появление анеуплоидных клеток и т.д. Такое явление стали называть лазерным мутагенезом. Важно установить, является ли оно следствием изменения генетической программы организма под влиянием внешнего дестабилизирующего фактора, т.е. индуцированным мутагенезом, или имеет иной механизм? Для этого необходимо проанализировать режимы облучения и биологические результаты, к которым оно приводит.
Существует значительное количество публикаций по так называемому лазерному мутагенезу, но нередко из-за методической некорректности нельзя определить подлинные параметры облучения. Обычно указывают такие характеристики, как мощность лазера, количество циклов обработки, действующую дозу или плотность дозы. Однако этого недостаточно для однозначной интерпретации плотности мощности светового потока, от величины которой в первую очередь зависят деструктивные процессы в клетке. Тем не менее, по ряду работ, содержащих необходимую информацию, удается получить вполне репрезентативную картину явления (см. таблицу).
Как следует из приведенных данных, длительные модификации (мутации?) растительных организмов вызывались сравнительно кратковременным действием лазерного излучения видимой области спектра (442–633 нм) с плотностью мощности 0,2–30 Вт/м2, т.е. в несколько десятков и сотен раз меньше естественной освещенности. Энергия квантов не превосходила 3 эВ, что недостаточно для разрыва ковалентных связей молекул.
Столь слабый световой раздражитель не может стать причиной повреждения наследственного аппарата клетки. Иначе, каждый восход Солнца мы встречали бы в мире новых, мутантных генотипов. На режимах, которые использованы в рассматриваемых работах (см.таблицу), деструктивные процессы маловероятны. Следует отметить, что в диапазоне длин волн 442–633 нм ни ДНК, ни связанные с ней гистонные белки излучение не поглощают. Таким образом, во многих случаях, которые относят к лазерному мутагенезу, отсутствуют предпосылки для прямого или опосредованного повреждения структуры и функций генетического аппарата клеток.
Механизмы, обеспечивающие устойчивое сохранение и передачу генетической информации, весьма надежны и полностью адаптированы к естественным условиям среды обитания [26–28]. Для того чтобы произошел их сбой, параметры действующего фактора должны выходить за пределы толерантности организма.
Избегая справедливых возражений, следует отметить, что при иных условиях и параметрах воздействия лазерное излучение может служить эффективным мутагенным фактором. В видимом диапазоне оптическое излучение способно влиять на наследственный аппарат клетки лишь при очень больших интенсивностях, порядка 105–1012 Вт/м2 или же в присутствии связанных с ДНК сенсибилизаторов. При этом повреждение генетически значимых молекул может проходить по термическому или двухфотонному механизмам, а также в результате фотоиндуцированных свободнорадикальных реакций [29–33].
Другой путь заключается в выборе соответствующего спектра генерации лазера. Оптическое излучение вызывает мутации при достаточно высокой энергии квантов, как правило, более 4 эВ, что соответствует ультрафиолетовому диапазону длин волн. Наиболее эффективной является область поглощения ДНК и белков (260–280 нм), в которой частота мутаций может на несколько порядков превосходить спонтанный уровень [34, 35].
Еще более интересным является применение интеркаляторов – хромофорных молекул или их групп, сопряженных с определенными участками полинуклеотидной цепи [30, 36]. Облучая такие комплексы интенсивным монохроматическим светом, удается инактивировать строго определенные последовательности ДНК, что в определенном смысле можно считать направленным мутагенезом.
Дестабилизирующие факторы, вызывающие мутагенез, как правило, приводят к снижению выживаемости организма, угнетению его функциональной активности. Большинство измененных форм во втором и последующих поколениях обладают слабым развитием и низкой продуктивностью [34]. Высокая частота мутаций отмечена на полулетальных и сублетальных дозах (ЛД50–ЛД90) и сопровождается массовой гибелью обработанных растений [37]. В случаях, классифицированных как лазерный мутагенез, имеет место иная картина. По приведенным выше литературным источникам, ее можно представить следующим образом:
Низкоинтенсивное лазерное облучение обеспечивает высокий выход модификаций, отличающихся от исходной формы по одному или нескольким признакам.
Модификации сохраняют устойчивость и могут наследоваться в течение ряда поколений (до 9, включительно).
Увеличивается частота хромосомных аберраций.
Количественные признаки изменяются существенно чаще, чем качественные.
Изменение количественных признаков происходит преимущественно в сторону их бóльших значений. Образуются хорошо развитые, высокопродуктивные формы растений, сохраняющие эти свойства при наследовании.
Выживаемость облученных организмов, как правило, не ниже, чем в контроле. Летальный эффект в первом и следующих поколениях наблюдается редко и, возможно, вызван иными причинами.
Лазерное облучение снижает частоту хромосомных аберраций и летальных мутаций, вызванных ионизирующей радиацией.
Здесь, несомненно, просматриваются признаки мутагенеза: хромосомные аберрации, индуцированная изменчивость и ее наследование, но остальные закономерности не типичны для этого явления. В то же время нельзя не заметить характерные черты эпигенетической регуляции функциональной активности растений. Наследуемые модификации возникали при облучении генеративных и вегетативных органов с помощью гелий-кадмиевого (442 нм), аргонового (476 нм) и гелий-неонового (633 нм) лазеров. Их длины волн совпадают со спектрами поглощения криптохрома и фитохрома. Эти хромопротеиды выполняют в растительных клетках важные регуляторные функции, контролируя многие процессы клеточного обмена: нуклеотидный, белковый, липидный, углеводный, энергетический; стимулируют синтез хлорофилла, каротиноидов, антоцианов, аскорбиновой кислоты и других веществ [31, 38].
Механизм действия хромопротеидов можно пояснить на примере фитохрома (ФХ) – рецепторе фотоморфогенеза. Он представляют собой ассоциированную с биомембраной белковую молекулу, имеющую хромофорный центр. Формой, стимулирующей физиологическую активность растений, является ФХ730. Ее высокая концентрация поддерживается излучением в спектральном интервале 600–690 нм. Действие дальнего красного света (700–780 нм) смещает равновесие в пользу ФХ660, что приводит к торможению клеточного метаболизма. При прямой фотоконверсии (ФХ660ФХ730) происходит структурно-функциональная перестройка сопряженного с фитохромом участка липидного бислоя. В результате увеличивается проницаемость клеточных мембран и десорбция регуляторных метаболитов с их поверхности [31, 38, 39].
Ф.Б.Мозесу и Нам Хай Чуа [40] удалось установить специфические участки полинуклиотидной цепи, имеющие высокое сродство к продуктам фитохромных реакций. Они получили название светорегулируемых элементов. Как оказалось, эти участки (регуляторные сайты) ДНК контролируют транскрипцию не одного, а нескольких различных генов. Их экспрессия обеспечивает синтез целого ряда структурных и регуляторных белков и, таким образом, влияет на формирование различных признаков организма [41, 42].
Фитохромные реакции являются эволюционно выработанными механизмами адаптации растений к изменению количества и качества света в течение суток. Повышенное содержание красных квантов в утренние часы способствует переходу фитохрома в активную форму и ускорению метобалических процессов в клетках. Подобным же образом действует излучение гелий-неоновых лазеров. При низкой интенсивности (0,2–30 Вт/м2, см.таблицу) оно соответствует экологической норме и не может служить причиной нарушения генетического аппарата растений. В то же время, длительность облучения 30–240 мин вполне достаточна для включения механизма дифференциальной экспрессии генов [40, 43] и изменению различных признаков организма. Важно установить, каким образом эта фенотипическая изменчивость может передаваться по наследству.
Как следует из полученных результатов, эффект действия низкоинтенсивного когерентного света заметен в течение времени, намного превышающего период облучения и релаксации продуктов фотореакции. Длительное запоминание сигнала предполагает наличие ячеек памяти – бистабильных элементов, имеющих устойчивые альтернативные состояния. В рамках эпигенетической регуляции таким элементом может быть двухоперонный триггер [44, 45]. Сущность явления заключается в возникновении обратной связи между двумя оперонами посредством их генных продуктов. Экспрессия блока генов одного оперона вызывает синтез белков-репрессоров, подавляющих транскрипцию другого оперона и наоборот. В результате возникает два устойчивых состояния, различающихся концентрацией соответствующих регуляторных метаболитов в цитоплазме клетки. Переключение из одного состояния в другое происходит под действием внутренних или внешних сигналов, нарушающих соотношение обратных связей между сопряженными оперонами, и носит дискретный, триггерный характер. Согласно концепции В.А. Ратнера [45, с.206], "Хранение информации в триггерной системе осуществляется двумя способами: структурная информация об элементах системы записана в локусах соответствующих оперонов; информация о состоянии триггера записана вне генома присутствием или отсутствием определенных репрессорных белков".
Проведенные нами исследования позволяют предположить, что длительное запоминание (сохранение) эффекта лазерной стимуляции происходит по описанному выше механизму. Вывод сделан на основании анализа логической модели, построенной по альтернативной схеме возможных событий. Базой данных для нее служили результаты эксперимента по предпосадочной обработке черенков растений излучением гелий-неонового лазера. В конце срока вегетации были измерены морфологические показатели полученных саженцев. Действие низкоинтенсивного лазерного излучения с длиной волны 632,8 нм усилило развитие однолетних растений. Оценить это количественно позволяет коэффициент стимуляции (коэффициент действия) k, равный отношению средних значений результативного признака в опыте и контроле. Теоретически, одна и та же величина данного коэффициента может быть получена при развитии двух альтернативных сценариев регуляторного процесса. Условно обозначим их как "аналоговый" и "дискретный". Каждому сценарию соответствует своя статистика распределения морфологических показателей.
Пусть при каком-то режиме облучения имеет место стимуляционный эффект и коэффициент k принимает некоторое экспериментально определенное значение k = kэ. В аналоговом варианте следует ожидать, что величина результативного признака в той или иной степени изменится у всех облученных растений. Их индивидуальные показатели будут случайным образом рассеяны вокруг наиболее вероятного значения так, чтобы суммарный вклад обеспечивал стимуляционный эффект с коэффициентом kэ. Вариационный ряд такой совокупности имеет одну вершину (моду).
В дискретном варианте, при триггерном переключении экспрессии генов, значение результативного признака должно стремиться к предельно возможной величине. При благоприятных условиях появятся растения, морфологические показатели которых существенно превосходят контрольный уровень. Тогда установленное значение коэффициента стимуляции kэ можно получить, только если функциональная активность изменится не у всех облученных организмов, а лишь у определенной части. Остальные же окажутся индифферентными к облучению, и их показатели останутся такими, как в контроле. В этом случае вариационный ряд будет иметь не один, а два максимума, т.е. распределение станет двумодальным.
Экспериментальная проверка адекватности альтернативных сценариев стимуляционного процесса проведена с помощью анализа вариационных рядов морфологических показателей однолетних растений смородины и облепихи. При лазерном облучении статистическое распределение таких показателей, как высота растений, суммарная длина побегов, число ветвей, длина корневой системы однолетних саженцев имело смещение границ норм реакций и вершин вариационных кривых в сторону бóльших значений результативного признака (рис.4 и 5). Кроме этого, наблюдали расщепление (трансгрессию) распределения морфологических показателей за счет появления особей с существенно более высокими ростовыми признаками, чем в контроле. Такие растения быстрее развивались и раньше приступали к плодоношению, т.е. более полно использовали свой адаптивный потенциал.
Факт трансгрессии говорит о том, что даже в генетически однородной совокупности (вегетативное размножение) не все растения одинаково реагируют на НКИ. Одна часть облученных особей оказалась полностью фоторезистентной (невосприимчивой) и имела такое же распределение ростовых признаков, как в контроле. Другая часть образовывала новый вариационный ряд в области бóльших значений этих признаков. При оптимизации режимов облучения, с ростом коэффициента стимуляции k увеличивалась доля растений, вышедших за правую границу нормы реакции в контроле. В этих же вариантах усиливалась и трансгрессия вариационных кривых (см.рис. 4).
Следует отметить, что в описываемых опытах использовали выборочные совокупности, каждая из которых насчитывала десятки и сотни растений. Однако они не отражают все возможные фенотипические реализации определенного генотипа. Представленный ими размах варьирования анализируемых признаков существенно меньше, чем в генеральной совокупности. Поэтому наблюдаемое смещение границ нормы реакции не может служить показателем генетической изменчивости, а указывают лишь на смену регуляторных отношений.
Проведенный анализ показывает, что адекватным является второй – дискретный – вариант сценария регуляторного процесса. Следовательно, при лазерном облучении переключение оперонов, ответственных за формирование морфологических признаков растений, происходит по триггерному механизму. Таким образом, длительное сохранение стимуляционного эффекта может поддерживаться эпигенетической системой за счет устойчивых бистабильных состояний соответствующих блоков генов.
Описанные закономерности ростовых процессов наблюдали у различных культур и сортов, но только при лазерном облучении. С течением времени они не сглаживались, наоборот: к концу вегетационного периода различия с контролем становились особенно заметными. Действие иных раздражителей, например ионизирующей радиации, не приводило к трансгрессии вариационных рядов. В области ингибирующих доз наблюдали смещение правой границы нормы реакции в область меньших значений признака (см.рис.5).
Эффект бистабильности при лазерном облучении проявляется на различных процессах и носит универсальный характер. Спецификой биорегуляторного действия НКИ является то, что оно вызывает бóльшую экспрессивность генов, чем факторы внешней среды. В результате возникают модификации, выходящие за границы нормы реакции контрольной (необлученной) совокупности особей. Как показывает эксперимент, эти модификации продолжают сохраняться в течение длительного времени.
Можно заключить, что НКИ не является мутагенным фактором и его применение не сопряжено с риском генетической модификации растений. Тогда наиболее вероятным становится эпигенетический механизм длительного запоминания стимуляционного эффекта. Явление, принимаемое за лазерный мутагенез, обусловлено другими процессами, хотя и приводящими к тем же последствиям. Еще раз подчеркнем, что все это относится только к низкоинтенсивному лазерному излучению видимой области спектра.
Литература
Будаговский А.В. Теория и практика лазерной обработки растений. – Мичуринск-наукоград, 2008.
Будаговский А.В. О способности клеток различать когерентность оптического излучения. – Квантовая электроника, 2005, 35, № 4, с.369–374.
А.С. СССР № 1512530 / Г.П. Дудин. Способ получения мутантов зерновых культур. Опубл. 06.08.1989. Бюл. № 37.
Володин В.Г. Лазеры и наследственность растений. – Минск: Наука и техника, 1984.
Шахов А.А. Фотоэнергетика растений и урожай. – М.: Наука, 1993.
Джелепов К. Цитогенетично действие на лазерните лъчи и влиянието им вьрху растежа, развитието и продуктивността на пшеницата.–Растениевьдни науки, 1985, v.22, №1. с.3–8.
Илиева В.П. Применение методов лазерной техники в сельском хозяйстве (обзорная информация). – София, 1987.
Gao C. Callus mutation by lasers for sorghum breeding. –Acta agron sinica, 1993. v. 19, № 1. p. 91–93.
Luo R. Study on biological effects of rice seeds irradiated by CO2 laser. –Acta Agriculturae Zhejiangensis (China), 1994. v. 6, № 1. p. 7–12.
Nakayima М. Cytogenetic effects of argon laser irradiation on Chineese hamster cells. – Rad. Res, 1983, v. 93, № 3. p. 598–608.
Plesnik S. Changes of correlation coefficients in quantitative traits in the M2 generation after laser unit and ethylenimine treatment in soybean / Plesnik S. // In: Soybean-genetics-newsletter. – USA: Agricultural-Research-Service (U.S. Department of Agriculture), 1991, v.18, p. 140–147.
Unnikrishna Pillaj P.R. Laser as mutagens. – J. Sci. and Ind. Res., 1998, v. 57, № 10–11, p. 658–663.
Vasileva M. Cytogenetic effect of helium-neon and argon laser in Pisum sativum. – Genetika I Selektsiya (Bulgaria), 1991, v. 24, № 2, p. 90–98.
Рудь Г.Я. Изменчивость линий кукурузы от действия лазерного облучения. – Проблемы фотоэнергетики растений. – Львов, 1978, c. 150–167.
Исследование мутагенного действия лазерного излучения в широком спектральном диапазоне на сельскохозяйственные культуры. Отчет о НИР (закл.) / АН БССР. Рук-ль В.А. Мостовников. – Л.2.27; ГР 79002778. – Минск, 1981.
Балаур Н.С. О мутагенном эффекте лазерного излучения. – В кн.: Проблемы фотоэнергетики растений. – Львов, 1978, c. 142–150.
Дмитриева А.Н. Применение лазерного и гамма-излучений, ПАБК на частоту Waxy мутаций ячменя. – В кн.: Применение низкоэнергетических факторов в биологии и сельском хозяйстве. – Киров, 1989, c.67–68.
Козаченко М.Р. Получение мутантов ярового ячменя при сочетании красного лазерного излучения с химическими мутагенами или проникающей радиацией: Применение низкоэнергетических факторов в биологии и сельском хозяйстве. – Киров, 1989, c. 77–78.
Пуртова И.В. Морфофизиологическое действие лазерного излучения и абсцизовой кислоты на растения ячменя в первом поколении. – В кн.: Применение низкоэнергетических факторов в биологии и сельском хозяйстве. – Киров, 1989, c. 92–93.
Дудин Г.П. Лазерный мутагенез у ячменя. Автореф. дис. на соиск. ст. д-ра биол. наук. – С.-Пб., 1993.
Rubinski W. Mutagenic effect of laser and chemical mutagens in barley. –Polish journal of theoretical and applied genetics, 1993, v. 34, № 4, p. 337–343.
Литвинова М.К. Изучение мутагенного действия лазерного излучения на столовую свеклу: Проблемы фотоэнергетики растений. – Львов, 1978, c. 175–180.
Йонуште Р. Использование лазерного излучения для получения наследственных изменений вики посевной. – В кн. Р. Йонуште Применение низкоэнергетических факторов в биологии и сельском хозяйстве. – Киров, 1989.
Дудина А.Н. Реакция сортов льна на лазерное воздействие в М1. – В кн.: А.Н. Дудина. Применение низкоэнергетических факторов в биологии и сельском хозяйстве. – Киров, 1989, c .70–71.
Рыжков С.Д. Фотоиндуцированная гибридизация в роде Ribes L.– В кн.:Тезисы докладов 6 Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений. – Львов, 1980, c. 146–147.
Албертс Б. Молекулярная биология. Том 2. – М.: Мир, 1994.
Виленчик М.М. О надежности функционирования биологической системы на молекулярном уровне. – В кн.: Методические и теоретические проблемы биофизики. – М.: Наука, 1979, c. 177–182.
Гродзинский Д.М. Надежность растительных систем. – Киев: Наукова думка, 1983.
Бурилков В.К. Биологическое действие лазерного излучения. –Кишинев: Штиинца, 1989.
Драган А.И. Молекулярные механизмы повреждающего действия лазерного излучения на ДНК. – Молекулярная биология, 1994, т.28, вып.2, c. 355–361.
Конев С.В. Фотобиология. – Минск: Из-во БГУ, 1979.
Красновский – мл. А.А. Механизм образования и роль синглетного кислорода в фотобиологических процессах. – В кн.: Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения: Сб. статей/Под ред. А.Б.Рубина. – М.: Наука, 1988, c. 23–41.
Никогосян Д.Н. Физические принципы нелинейной лазерной биологии . – В кн.: Д.Н. Никогосян. Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения: Сб. статей / Под ред. А.Б. Рубина. – М.: Наука, 1988, c. 70–78.
Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. – М.: Мир, 1978.
Смит К. Молекулярная фотобиология. – М.: Мир, 1972.
Синяк В.А., Шекун Ю.Г. Лазерное расщепление. – Кишинев: Штиинца, 1991.
Митрофанов Ю.А. Индуцированный мутационный процесс эукариот (механизмы мутагенеза). – М.: Наука, 1980.
Волотовский И.Д. Фитохром – фоторегуляторный рецептор. – Минск: Наука и техника, 1992.
Chamovitz D.A. Light Signaling in Plants. – Critical Reviews in Plant Sciences. 1996, v. 15, p. 455–478.
Мозес Ф.Б. Световые переключатели генов у растений. – В мире науки, 1988, № 6, c. 45–50.
Кузнецов Е.Д. Роль фитохрома в растениях. – М.: Агропромиздат, 1986.
Kuhlemeier C. Regulation of gene expression in higher. – Annual Review of Plant Physiology, 1987, v. 38, p. 221–257.
Гудвин Б. Временная организация клетки. – М.: Мир, 1966.
Моно Ж. Общие выводы: телеономические механизмы в процессах клеточного обмена, роста и дифференцировки. – В кн.: Регуляторные механизмы клетки. – М.: Мир, 1964, c. 477–497.
Ратнер В.А. Молекулярно-генетические системы управления. – Новосибирск: Наука, 1975.
Облученные черенки растений не только укореняются лучше контрольных, но и превосходят их по росту и развитию в течение всего периода вегетации (рис.1) [1]. Иммунная реакция обработанных лазерным светом плодов выше, чем у не обработанных, о чем можно судить по величине потерь товарной продукции от гнилей (рис.2). В процессе хранения различия с контролем не нивелируются, а, наоборот, становился более заметным (рис.3). Важно отметить, что физиологическая активность клеток плодов возрастает лишь при достаточно большом объеме когерентности действующего поля [2]. Низкокогерентное излучение активизирует только мелкие клетки патогена, усиливая поражение яблок.
Исследования, проведенные в нашей стране и за рубежом, показали, что стимуляционный эффект НКИ может не только длительное время сохраняться, но и передаваться следующим поколениям [3–13]. При этом наблюдали целый ряд характерных для мутагенеза черт: изменение количественных и качественных признаков, их сохранение при вегетативном или генеративном размножении растений, образование хромосомных аберраций, появление анеуплоидных клеток и т.д. Такое явление стали называть лазерным мутагенезом. Важно установить, является ли оно следствием изменения генетической программы организма под влиянием внешнего дестабилизирующего фактора, т.е. индуцированным мутагенезом, или имеет иной механизм? Для этого необходимо проанализировать режимы облучения и биологические результаты, к которым оно приводит.
Существует значительное количество публикаций по так называемому лазерному мутагенезу, но нередко из-за методической некорректности нельзя определить подлинные параметры облучения. Обычно указывают такие характеристики, как мощность лазера, количество циклов обработки, действующую дозу или плотность дозы. Однако этого недостаточно для однозначной интерпретации плотности мощности светового потока, от величины которой в первую очередь зависят деструктивные процессы в клетке. Тем не менее, по ряду работ, содержащих необходимую информацию, удается получить вполне репрезентативную картину явления (см. таблицу).
Как следует из приведенных данных, длительные модификации (мутации?) растительных организмов вызывались сравнительно кратковременным действием лазерного излучения видимой области спектра (442–633 нм) с плотностью мощности 0,2–30 Вт/м2, т.е. в несколько десятков и сотен раз меньше естественной освещенности. Энергия квантов не превосходила 3 эВ, что недостаточно для разрыва ковалентных связей молекул.
Столь слабый световой раздражитель не может стать причиной повреждения наследственного аппарата клетки. Иначе, каждый восход Солнца мы встречали бы в мире новых, мутантных генотипов. На режимах, которые использованы в рассматриваемых работах (см.таблицу), деструктивные процессы маловероятны. Следует отметить, что в диапазоне длин волн 442–633 нм ни ДНК, ни связанные с ней гистонные белки излучение не поглощают. Таким образом, во многих случаях, которые относят к лазерному мутагенезу, отсутствуют предпосылки для прямого или опосредованного повреждения структуры и функций генетического аппарата клеток.
Механизмы, обеспечивающие устойчивое сохранение и передачу генетической информации, весьма надежны и полностью адаптированы к естественным условиям среды обитания [26–28]. Для того чтобы произошел их сбой, параметры действующего фактора должны выходить за пределы толерантности организма.
Избегая справедливых возражений, следует отметить, что при иных условиях и параметрах воздействия лазерное излучение может служить эффективным мутагенным фактором. В видимом диапазоне оптическое излучение способно влиять на наследственный аппарат клетки лишь при очень больших интенсивностях, порядка 105–1012 Вт/м2 или же в присутствии связанных с ДНК сенсибилизаторов. При этом повреждение генетически значимых молекул может проходить по термическому или двухфотонному механизмам, а также в результате фотоиндуцированных свободнорадикальных реакций [29–33].
Другой путь заключается в выборе соответствующего спектра генерации лазера. Оптическое излучение вызывает мутации при достаточно высокой энергии квантов, как правило, более 4 эВ, что соответствует ультрафиолетовому диапазону длин волн. Наиболее эффективной является область поглощения ДНК и белков (260–280 нм), в которой частота мутаций может на несколько порядков превосходить спонтанный уровень [34, 35].
Еще более интересным является применение интеркаляторов – хромофорных молекул или их групп, сопряженных с определенными участками полинуклеотидной цепи [30, 36]. Облучая такие комплексы интенсивным монохроматическим светом, удается инактивировать строго определенные последовательности ДНК, что в определенном смысле можно считать направленным мутагенезом.
Дестабилизирующие факторы, вызывающие мутагенез, как правило, приводят к снижению выживаемости организма, угнетению его функциональной активности. Большинство измененных форм во втором и последующих поколениях обладают слабым развитием и низкой продуктивностью [34]. Высокая частота мутаций отмечена на полулетальных и сублетальных дозах (ЛД50–ЛД90) и сопровождается массовой гибелью обработанных растений [37]. В случаях, классифицированных как лазерный мутагенез, имеет место иная картина. По приведенным выше литературным источникам, ее можно представить следующим образом:
Низкоинтенсивное лазерное облучение обеспечивает высокий выход модификаций, отличающихся от исходной формы по одному или нескольким признакам.
Модификации сохраняют устойчивость и могут наследоваться в течение ряда поколений (до 9, включительно).
Увеличивается частота хромосомных аберраций.
Количественные признаки изменяются существенно чаще, чем качественные.
Изменение количественных признаков происходит преимущественно в сторону их бóльших значений. Образуются хорошо развитые, высокопродуктивные формы растений, сохраняющие эти свойства при наследовании.
Выживаемость облученных организмов, как правило, не ниже, чем в контроле. Летальный эффект в первом и следующих поколениях наблюдается редко и, возможно, вызван иными причинами.
Лазерное облучение снижает частоту хромосомных аберраций и летальных мутаций, вызванных ионизирующей радиацией.
Здесь, несомненно, просматриваются признаки мутагенеза: хромосомные аберрации, индуцированная изменчивость и ее наследование, но остальные закономерности не типичны для этого явления. В то же время нельзя не заметить характерные черты эпигенетической регуляции функциональной активности растений. Наследуемые модификации возникали при облучении генеративных и вегетативных органов с помощью гелий-кадмиевого (442 нм), аргонового (476 нм) и гелий-неонового (633 нм) лазеров. Их длины волн совпадают со спектрами поглощения криптохрома и фитохрома. Эти хромопротеиды выполняют в растительных клетках важные регуляторные функции, контролируя многие процессы клеточного обмена: нуклеотидный, белковый, липидный, углеводный, энергетический; стимулируют синтез хлорофилла, каротиноидов, антоцианов, аскорбиновой кислоты и других веществ [31, 38].
Механизм действия хромопротеидов можно пояснить на примере фитохрома (ФХ) – рецепторе фотоморфогенеза. Он представляют собой ассоциированную с биомембраной белковую молекулу, имеющую хромофорный центр. Формой, стимулирующей физиологическую активность растений, является ФХ730. Ее высокая концентрация поддерживается излучением в спектральном интервале 600–690 нм. Действие дальнего красного света (700–780 нм) смещает равновесие в пользу ФХ660, что приводит к торможению клеточного метаболизма. При прямой фотоконверсии (ФХ660ФХ730) происходит структурно-функциональная перестройка сопряженного с фитохромом участка липидного бислоя. В результате увеличивается проницаемость клеточных мембран и десорбция регуляторных метаболитов с их поверхности [31, 38, 39].
Ф.Б.Мозесу и Нам Хай Чуа [40] удалось установить специфические участки полинуклиотидной цепи, имеющие высокое сродство к продуктам фитохромных реакций. Они получили название светорегулируемых элементов. Как оказалось, эти участки (регуляторные сайты) ДНК контролируют транскрипцию не одного, а нескольких различных генов. Их экспрессия обеспечивает синтез целого ряда структурных и регуляторных белков и, таким образом, влияет на формирование различных признаков организма [41, 42].
Фитохромные реакции являются эволюционно выработанными механизмами адаптации растений к изменению количества и качества света в течение суток. Повышенное содержание красных квантов в утренние часы способствует переходу фитохрома в активную форму и ускорению метобалических процессов в клетках. Подобным же образом действует излучение гелий-неоновых лазеров. При низкой интенсивности (0,2–30 Вт/м2, см.таблицу) оно соответствует экологической норме и не может служить причиной нарушения генетического аппарата растений. В то же время, длительность облучения 30–240 мин вполне достаточна для включения механизма дифференциальной экспрессии генов [40, 43] и изменению различных признаков организма. Важно установить, каким образом эта фенотипическая изменчивость может передаваться по наследству.
Как следует из полученных результатов, эффект действия низкоинтенсивного когерентного света заметен в течение времени, намного превышающего период облучения и релаксации продуктов фотореакции. Длительное запоминание сигнала предполагает наличие ячеек памяти – бистабильных элементов, имеющих устойчивые альтернативные состояния. В рамках эпигенетической регуляции таким элементом может быть двухоперонный триггер [44, 45]. Сущность явления заключается в возникновении обратной связи между двумя оперонами посредством их генных продуктов. Экспрессия блока генов одного оперона вызывает синтез белков-репрессоров, подавляющих транскрипцию другого оперона и наоборот. В результате возникает два устойчивых состояния, различающихся концентрацией соответствующих регуляторных метаболитов в цитоплазме клетки. Переключение из одного состояния в другое происходит под действием внутренних или внешних сигналов, нарушающих соотношение обратных связей между сопряженными оперонами, и носит дискретный, триггерный характер. Согласно концепции В.А. Ратнера [45, с.206], "Хранение информации в триггерной системе осуществляется двумя способами: структурная информация об элементах системы записана в локусах соответствующих оперонов; информация о состоянии триггера записана вне генома присутствием или отсутствием определенных репрессорных белков".
Проведенные нами исследования позволяют предположить, что длительное запоминание (сохранение) эффекта лазерной стимуляции происходит по описанному выше механизму. Вывод сделан на основании анализа логической модели, построенной по альтернативной схеме возможных событий. Базой данных для нее служили результаты эксперимента по предпосадочной обработке черенков растений излучением гелий-неонового лазера. В конце срока вегетации были измерены морфологические показатели полученных саженцев. Действие низкоинтенсивного лазерного излучения с длиной волны 632,8 нм усилило развитие однолетних растений. Оценить это количественно позволяет коэффициент стимуляции (коэффициент действия) k, равный отношению средних значений результативного признака в опыте и контроле. Теоретически, одна и та же величина данного коэффициента может быть получена при развитии двух альтернативных сценариев регуляторного процесса. Условно обозначим их как "аналоговый" и "дискретный". Каждому сценарию соответствует своя статистика распределения морфологических показателей.
Пусть при каком-то режиме облучения имеет место стимуляционный эффект и коэффициент k принимает некоторое экспериментально определенное значение k = kэ. В аналоговом варианте следует ожидать, что величина результативного признака в той или иной степени изменится у всех облученных растений. Их индивидуальные показатели будут случайным образом рассеяны вокруг наиболее вероятного значения так, чтобы суммарный вклад обеспечивал стимуляционный эффект с коэффициентом kэ. Вариационный ряд такой совокупности имеет одну вершину (моду).
В дискретном варианте, при триггерном переключении экспрессии генов, значение результативного признака должно стремиться к предельно возможной величине. При благоприятных условиях появятся растения, морфологические показатели которых существенно превосходят контрольный уровень. Тогда установленное значение коэффициента стимуляции kэ можно получить, только если функциональная активность изменится не у всех облученных организмов, а лишь у определенной части. Остальные же окажутся индифферентными к облучению, и их показатели останутся такими, как в контроле. В этом случае вариационный ряд будет иметь не один, а два максимума, т.е. распределение станет двумодальным.
Экспериментальная проверка адекватности альтернативных сценариев стимуляционного процесса проведена с помощью анализа вариационных рядов морфологических показателей однолетних растений смородины и облепихи. При лазерном облучении статистическое распределение таких показателей, как высота растений, суммарная длина побегов, число ветвей, длина корневой системы однолетних саженцев имело смещение границ норм реакций и вершин вариационных кривых в сторону бóльших значений результативного признака (рис.4 и 5). Кроме этого, наблюдали расщепление (трансгрессию) распределения морфологических показателей за счет появления особей с существенно более высокими ростовыми признаками, чем в контроле. Такие растения быстрее развивались и раньше приступали к плодоношению, т.е. более полно использовали свой адаптивный потенциал.
Факт трансгрессии говорит о том, что даже в генетически однородной совокупности (вегетативное размножение) не все растения одинаково реагируют на НКИ. Одна часть облученных особей оказалась полностью фоторезистентной (невосприимчивой) и имела такое же распределение ростовых признаков, как в контроле. Другая часть образовывала новый вариационный ряд в области бóльших значений этих признаков. При оптимизации режимов облучения, с ростом коэффициента стимуляции k увеличивалась доля растений, вышедших за правую границу нормы реакции в контроле. В этих же вариантах усиливалась и трансгрессия вариационных кривых (см.рис. 4).
Следует отметить, что в описываемых опытах использовали выборочные совокупности, каждая из которых насчитывала десятки и сотни растений. Однако они не отражают все возможные фенотипические реализации определенного генотипа. Представленный ими размах варьирования анализируемых признаков существенно меньше, чем в генеральной совокупности. Поэтому наблюдаемое смещение границ нормы реакции не может служить показателем генетической изменчивости, а указывают лишь на смену регуляторных отношений.
Проведенный анализ показывает, что адекватным является второй – дискретный – вариант сценария регуляторного процесса. Следовательно, при лазерном облучении переключение оперонов, ответственных за формирование морфологических признаков растений, происходит по триггерному механизму. Таким образом, длительное сохранение стимуляционного эффекта может поддерживаться эпигенетической системой за счет устойчивых бистабильных состояний соответствующих блоков генов.
Описанные закономерности ростовых процессов наблюдали у различных культур и сортов, но только при лазерном облучении. С течением времени они не сглаживались, наоборот: к концу вегетационного периода различия с контролем становились особенно заметными. Действие иных раздражителей, например ионизирующей радиации, не приводило к трансгрессии вариационных рядов. В области ингибирующих доз наблюдали смещение правой границы нормы реакции в область меньших значений признака (см.рис.5).
Эффект бистабильности при лазерном облучении проявляется на различных процессах и носит универсальный характер. Спецификой биорегуляторного действия НКИ является то, что оно вызывает бóльшую экспрессивность генов, чем факторы внешней среды. В результате возникают модификации, выходящие за границы нормы реакции контрольной (необлученной) совокупности особей. Как показывает эксперимент, эти модификации продолжают сохраняться в течение длительного времени.
Можно заключить, что НКИ не является мутагенным фактором и его применение не сопряжено с риском генетической модификации растений. Тогда наиболее вероятным становится эпигенетический механизм длительного запоминания стимуляционного эффекта. Явление, принимаемое за лазерный мутагенез, обусловлено другими процессами, хотя и приводящими к тем же последствиям. Еще раз подчеркнем, что все это относится только к низкоинтенсивному лазерному излучению видимой области спектра.
Литература
Будаговский А.В. Теория и практика лазерной обработки растений. – Мичуринск-наукоград, 2008.
Будаговский А.В. О способности клеток различать когерентность оптического излучения. – Квантовая электроника, 2005, 35, № 4, с.369–374.
А.С. СССР № 1512530 / Г.П. Дудин. Способ получения мутантов зерновых культур. Опубл. 06.08.1989. Бюл. № 37.
Володин В.Г. Лазеры и наследственность растений. – Минск: Наука и техника, 1984.
Шахов А.А. Фотоэнергетика растений и урожай. – М.: Наука, 1993.
Джелепов К. Цитогенетично действие на лазерните лъчи и влиянието им вьрху растежа, развитието и продуктивността на пшеницата.–Растениевьдни науки, 1985, v.22, №1. с.3–8.
Илиева В.П. Применение методов лазерной техники в сельском хозяйстве (обзорная информация). – София, 1987.
Gao C. Callus mutation by lasers for sorghum breeding. –Acta agron sinica, 1993. v. 19, № 1. p. 91–93.
Luo R. Study on biological effects of rice seeds irradiated by CO2 laser. –Acta Agriculturae Zhejiangensis (China), 1994. v. 6, № 1. p. 7–12.
Nakayima М. Cytogenetic effects of argon laser irradiation on Chineese hamster cells. – Rad. Res, 1983, v. 93, № 3. p. 598–608.
Plesnik S. Changes of correlation coefficients in quantitative traits in the M2 generation after laser unit and ethylenimine treatment in soybean / Plesnik S. // In: Soybean-genetics-newsletter. – USA: Agricultural-Research-Service (U.S. Department of Agriculture), 1991, v.18, p. 140–147.
Unnikrishna Pillaj P.R. Laser as mutagens. – J. Sci. and Ind. Res., 1998, v. 57, № 10–11, p. 658–663.
Vasileva M. Cytogenetic effect of helium-neon and argon laser in Pisum sativum. – Genetika I Selektsiya (Bulgaria), 1991, v. 24, № 2, p. 90–98.
Рудь Г.Я. Изменчивость линий кукурузы от действия лазерного облучения. – Проблемы фотоэнергетики растений. – Львов, 1978, c. 150–167.
Исследование мутагенного действия лазерного излучения в широком спектральном диапазоне на сельскохозяйственные культуры. Отчет о НИР (закл.) / АН БССР. Рук-ль В.А. Мостовников. – Л.2.27; ГР 79002778. – Минск, 1981.
Балаур Н.С. О мутагенном эффекте лазерного излучения. – В кн.: Проблемы фотоэнергетики растений. – Львов, 1978, c. 142–150.
Дмитриева А.Н. Применение лазерного и гамма-излучений, ПАБК на частоту Waxy мутаций ячменя. – В кн.: Применение низкоэнергетических факторов в биологии и сельском хозяйстве. – Киров, 1989, c.67–68.
Козаченко М.Р. Получение мутантов ярового ячменя при сочетании красного лазерного излучения с химическими мутагенами или проникающей радиацией: Применение низкоэнергетических факторов в биологии и сельском хозяйстве. – Киров, 1989, c. 77–78.
Пуртова И.В. Морфофизиологическое действие лазерного излучения и абсцизовой кислоты на растения ячменя в первом поколении. – В кн.: Применение низкоэнергетических факторов в биологии и сельском хозяйстве. – Киров, 1989, c. 92–93.
Дудин Г.П. Лазерный мутагенез у ячменя. Автореф. дис. на соиск. ст. д-ра биол. наук. – С.-Пб., 1993.
Rubinski W. Mutagenic effect of laser and chemical mutagens in barley. –Polish journal of theoretical and applied genetics, 1993, v. 34, № 4, p. 337–343.
Литвинова М.К. Изучение мутагенного действия лазерного излучения на столовую свеклу: Проблемы фотоэнергетики растений. – Львов, 1978, c. 175–180.
Йонуште Р. Использование лазерного излучения для получения наследственных изменений вики посевной. – В кн. Р. Йонуште Применение низкоэнергетических факторов в биологии и сельском хозяйстве. – Киров, 1989.
Дудина А.Н. Реакция сортов льна на лазерное воздействие в М1. – В кн.: А.Н. Дудина. Применение низкоэнергетических факторов в биологии и сельском хозяйстве. – Киров, 1989, c .70–71.
Рыжков С.Д. Фотоиндуцированная гибридизация в роде Ribes L.– В кн.:Тезисы докладов 6 Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений. – Львов, 1980, c. 146–147.
Албертс Б. Молекулярная биология. Том 2. – М.: Мир, 1994.
Виленчик М.М. О надежности функционирования биологической системы на молекулярном уровне. – В кн.: Методические и теоретические проблемы биофизики. – М.: Наука, 1979, c. 177–182.
Гродзинский Д.М. Надежность растительных систем. – Киев: Наукова думка, 1983.
Бурилков В.К. Биологическое действие лазерного излучения. –Кишинев: Штиинца, 1989.
Драган А.И. Молекулярные механизмы повреждающего действия лазерного излучения на ДНК. – Молекулярная биология, 1994, т.28, вып.2, c. 355–361.
Конев С.В. Фотобиология. – Минск: Из-во БГУ, 1979.
Красновский – мл. А.А. Механизм образования и роль синглетного кислорода в фотобиологических процессах. – В кн.: Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения: Сб. статей/Под ред. А.Б.Рубина. – М.: Наука, 1988, c. 23–41.
Никогосян Д.Н. Физические принципы нелинейной лазерной биологии . – В кн.: Д.Н. Никогосян. Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения: Сб. статей / Под ред. А.Б. Рубина. – М.: Наука, 1988, c. 70–78.
Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. – М.: Мир, 1978.
Смит К. Молекулярная фотобиология. – М.: Мир, 1972.
Синяк В.А., Шекун Ю.Г. Лазерное расщепление. – Кишинев: Штиинца, 1991.
Митрофанов Ю.А. Индуцированный мутационный процесс эукариот (механизмы мутагенеза). – М.: Наука, 1980.
Волотовский И.Д. Фитохром – фоторегуляторный рецептор. – Минск: Наука и техника, 1992.
Chamovitz D.A. Light Signaling in Plants. – Critical Reviews in Plant Sciences. 1996, v. 15, p. 455–478.
Мозес Ф.Б. Световые переключатели генов у растений. – В мире науки, 1988, № 6, c. 45–50.
Кузнецов Е.Д. Роль фитохрома в растениях. – М.: Агропромиздат, 1986.
Kuhlemeier C. Regulation of gene expression in higher. – Annual Review of Plant Physiology, 1987, v. 38, p. 221–257.
Гудвин Б. Временная организация клетки. – М.: Мир, 1966.
Моно Ж. Общие выводы: телеономические механизмы в процессах клеточного обмена, роста и дифференцировки. – В кн.: Регуляторные механизмы клетки. – М.: Мир, 1964, c. 477–497.
Ратнер В.А. Молекулярно-генетические системы управления. – Новосибирск: Наука, 1975.
Отзывы читателей
