eng
Выпуск #6/2010
А.Будаговский, О.Будаговская, И.Будаговский
Парадоксы оптических свойств зеленых клеток и их практическое применение
Парадоксы оптических свойств зеленых клеток и их практическое применение
Просмотры: 4226
Разработан метод диагностики функционального состояния растений по измерению амплитудно-фазовых характеристик рассеянного на растительной ткани квазимонохроматического излучения зондирующего лазерного пучка. Метод позволяет оценить состояние и не фотосинтезирующих тканей растений по степени упорядоченности их микроструктурной организации.
Теги: chlorophyllfluorescence spatial coherence tissue laser analysis лазерный анализ тканей пространственная когерентность хлорофиллфлуоресценция
Существует большое количество оптических методов, позволяющих исследовать растительные организмы. Так, например, по коэффициенту пропускания или отражения квазимонохроматического пучка света можно судить о концентрации хлорофилла, каротиноидов и антоцианов в листьях; спектральные характеристики плодов используют для оценки зрелости и качества; лазерное сканирование агроценозов позволяет определить их продуктивность [1–4]. Полагают, что при взаимодействии зондирующего пучка с растительной тканью ее оптические свойства остаются стабильными. А если какие-либо изменения и происходят, то достаточно медленно, и они становятся заметными спустя время, значительно превосходящее длительность измерений. Относительное постоянство оптических свойств растений стало интуитивной аксиомой и легло в основу многих методов исследования их функционального (физиологического) состояния. Но реальная ситуация оказалась значительно сложнее.
Зондирующий пучок квазимонохроматического, в частности, лазерного излучения, претерпевает сложные превращения при взаимодействии с растительной тканью. Если в ней есть клетки, содержащие зеленый пигмент хлорофилл, то наблюдаемые эффекты особенно интересны и носят, казалось бы, парадоксальный характер. Заключается это в сравнительно быстром спаде интенсивности и росте когерентности рассеянного зондирующего пучка в процессе измерений (рис.1). Уже в первые несколько секунд изменение оптических показателей как в режиме пропускания, так и отражения света (рис.2) достигает десятков процентов. Это легко регистрируется амплитудно-фазовым детектором с неселективным фотоприемником [5].
Рассмотрим, какие именно превращения испытывает лазерный луч в фотосинтезирующей ткани растений и как это можно использовать для практических целей. Пусть на живой зеленый лист падает квазимонохроматический пучок света интенсивностью I0 и длиной волны λ0 ± Δλ0. Из условия монохроматичности следует: Δλ0<<λ0. Часть света (RI0, где R – коэффициент отражения) отразится на границе раздела сред. Другая часть (AI0, где A – коэффициент поглощения) будет поглощена листом. Оставшаяся часть зондирующего потока (ТI0, где Т – коэффициент пропускания), претерпев рассеяние, выйдет за пределы листовой пластинки.
Поглощенный зелеными тканями растения свет частично диссипирует в тепло, частично расходуется на фотохимические реакции фотосинтеза, а частично высвечивается в виде хлорофиллфлуоресценции (ХФ). Ее спектр лежит в области 660–800 нм, с максимумами в районе 690 и 740 нм. В результате возникает комбинированный оптический сигнал, содержащий два типа излучений различной природы: рассеянный зондирующий пучок и индуцированная им флуоресценция хлорофилла.
К первому типу относятся отраженный RI0 и прошедший ТI0 пучки света. Они будут иметь тот же спектральный состав, что и зондирующий поток, однако их статистическая упорядоченность (когерентность) изменится. Это связано с оптической гетерогенностью растительной ткани и упругим рассеянием света на ее микронеоднородностях. В результате происходит уширение углового спектра лазерного пучка и снижение его радиуса корреляции. Речь идет о корреляции фаз в фотонном коллективе, радиус корреляции является характеристическим значением пространственной поперечной корреляционной функции световой волны, описывающей ее пространственную когерентность. Ткань растения в этом случае представляется в виде стохастического фазового экрана, параметры которого связаны с корреляционной функцией рассеянного излучения:
(1)
Фазовый экран – среда, в которой происходит изменение фаз фотонного коллектива, в стохастическом фазовом экране оптические неоднороности располагаются произвольно, не упорядочены, т.е. в определенной мере стохастизированы. В выражении (1) для Г (s) – комплексной степени пространственной когерентности – принято, что s – разность хода в поперечном сечении зондирующего пучка; a – ширина оптических неоднородностей; ω(h) – функция распределения неоднородностей фазового экрана по высоте h; λ – длина волны зондирующего излучения. Как видно из уравнения (1), степень когерентности рассеянного излучения определяется параметрами неоднородностей ткани и может служить мерой ее микроструктурной организации.
Амплитудные характеристики зондирующего излучения также представляют определенный интерес для анализа растений. Взаимодействуя с тканью, световая волна уменьшает свою интенсивность, что для случая однократного рассеяния может быть описано следующим выражением [6]:
I = I0e(-NabsCabsl)e(-NscaCscal), (2)
где I0 и I – интенсивность излучения до и после взаимодействия с объектом; l – длина оптического пути, Nabs и Cabs – концентрация и эффективное сечение поглощающих частиц; Nsca и Csca – концентрация и эффективное сечение рассеивающих частиц.
Измерение амплитудно-фазовых характеристик рассеянного зондирующего пучка позволяет дать количественную оценку функционального состояния растений. Такой метод диагностики получил название ЛАМ: лазерный анализ микроструктуры (тканей). Проведенные исследования показали, что действие различных дестабилизирующих факторов (физических, химических, биотических), нарушающих нормальное функционирование организма, обнаруживается по снижению статистической упорядоченности рассеянного излучения и изменению его интенсивности [7, 8]. Типичной иллюстрацией служит динамика патогенеза (заражения) растительной ткани (рис.3). В здоровой ткани (точка 1) когерентный пучок сильно поглощался, но сохранял значительную часть своей пространственной когерентности
(I ≈ 109; G ≈ 39%)*. Учитывая выбранную длину волны (632,8 нм), основным пигментом, поглощающим кванты света, можно считать хлорофилл. В латентной фазе развития инфекции (точка 2) концентрация хлорофилла оставалась неизменной, но стало заметно нарушение микроструктуры ткани. Пространственная когерентность рассеянного зондирующего пучка снизилась до 32%. Появление видимых симптомов заболевания (точка 3) сопровождалось дальнейшей стохастизацией (уменьшением когерентности) светового потока (G ≈ 23%) на фоне роста его интенсивности (I ≈ 163). Причина, вероятно, связана с нарушением структуры ткани и началом разрушения хлорофиллбелкового комплекса. При сильном развитии инфекции (точка 4) амплитудно-фазовые характеристики рассеянного зондирующего пучка претерпели двукратное изменение (I ≈ 204; G ≈ 16%).
Описанные процессы проходили сравнительно медленно, в течение десятков часов. Их можно считать квазистационарными. Однако свет способен вызвать и более динамичную конверсию (от лат. conversio изменение, превращение) оптических свойств растительной ткани, которая протекает за несколько десятков или даже единиц минут. Обусловлено это изменением формы, размеров и положения хлоропластов в клетке, движением цитоплазмы, а также фотодеструкцией хлорофилла [9, 10]. То есть, амплитудно-фазовые характеристики рассеянного растительной тканью света следует считать не постоянными, а медленно меняющимися и учитывать это при проведении измерений.
Вторым типом излучения, содержащегося в регистрируемом сигнале, является хлорофиллфлуоресценция. Она обладает низкой когерентностью вследствие отсутствия корреляции между элементарными актами испускания фотонов. Ее интенсивность F зависит от квантового выхода флуоресценции ϕF и числа поглощенных фотонов AI0, т.е.
F = ϕFAI0. В этом случае интенсивность света принято представлять в мкмоль фотонов умноженное на м-2с-1, где моль фотонов равен числу Авогадро. Для возбуждения ХФ целесообразно использовать свет, соответствующий спектральным максимумам поглощения хлорофилла. Например, зондирующее излучение полупроводникового лазера с длиной волны 650 нм поглощается листьями на 85–95% в зависимости от содержания в них зеленого пигмента [11]. У фотосинтезирующих тканей средний квантовый выход флуоресценции составляет 0,01–0,1 [12, 13]. Тогда интенсивность флуоресценции даже с учетом реабсорбции (вторичного поглощения) может достигать 3–5% от величины зондирующего потока I0. Вблизи λ0=650 нм коэффициенты пропускания и отражения листьев также составляет единицы процентов [1, 11]. Следовательно, интенсивности рассеянного зондирующего пучка с длиной волны λ0 и хлорофиллфлуоресценции в более длинноволновой области будут приблизительно равными.
Характерной особенностью ХФ является то, что ее квантовый выход зависит от интенсивности, а также длительности воздействия света и может изменяться в широких пределах. При низкой освещенности, когда практически все реакционные центры фотосистемы открыты, большая часть поглощенных квантов участвует в фотохимическом процессе и ХФ имеет минимальный уровень F0. При попадании на лист достаточно яркого (но не повреждающего) света, например, зондирующего пучка, происходит перенасыщение реакционных центров и они перестают выполнять фотосинтетическую функцию (закрываются). Избыток энергии возбуждения расходуется на флуоресценцию, которая достигает своего максимального значения Fm. Происходит так называемая быстрая фаза индукции флуоресценции хлорофилла (ИФХ). Относительный выход переменной флуоресценции: (Fm–Fo)/Fm характеризует эффективность первичных процессов фотосинтеза [12, 13]. Длительность переходного периода измеряется долями секунды. За это время интенсивность ХФ может возрасти в несколько раз и значительно превысить величину светового потока рассеянного излучения: RI0 или ТI0. Если зондирующий пучок и далее продолжает воздействовать на лист, начинается адаптация фотосинтетического аппарата клеток к интенсивному свету. Реакционные центры постепенно открываются, что приводит к снижению квантового выхода ХФ.
Это медленная фаза ИФХ, которая продолжается десятки
секунд [14].
Определяемая эффектом Каутского [15] (изменение интенсивности флюоресценции хлорофилла, происходящее под действием достаточно яркого света, отражает работу фотосинтетического аппарата клетки) кинетика ИФХ показывает состояние фотосинтетического аппарата клетки и служит важным диагностическим показателем. В то же время она усложняет оценку оптических свойств растительных тканей. Связано это с тем, что фотоприемники (фотодиоды, ФЭУ, CCD-камеры), которые обычно используют для измерения оптических потоков, обладают чувствительностью в широком диапазоне длин волн. Без специальных мер они не могут различать зондирующий поток и индуцированную им флуоресценцию хлорофилла. Неселективный фотодетектор зарегистрирует комбинированный световой сигнал, содержащий два компонента, различающихся по когерентности, спектральному диапазону и скорости изменения своей интенсивности. Именно такая картина представлена на рис.1. Спад интенсивности обусловлен снижением квантового выхода хлорофиллфлуоресценции в медленной фазе ИФХ. Эта же причина вызвала рост когерентности светового потока: в комбинированном сигнале уменьшился стохастический компонент, т.е. ХФ, а когерентный, полученный в результате упругого рассеяния зондирующего пучка, остался без значительных изменений.
Применение селективных фотоприемников позволяет провести независимую оценку микроструктурной организации ткани и ее фотосинтетической активности. Не меньший интерес представляет и прямое измерение комбинированного сигнала, содержащего когерентный и некогерентный (точнее, низкокогерентный) компоненты. Для экспресс-диагностики растительных организмов могут быть использованы амплитудно-фазовые (интенсивность и когерентность) характеристики такого излучения. Установлено, что чем больше величина и скорость их изменения, тем выше функциональная активность биологического объекта (рис.4). Аналитическое описание кинетических процессов удобно провести посредством аппроксимации рядов экспериментальных данных степенными уравнениями регрессии вида G(t); I(t) = Atb. Показатель степени b (динамический показатель) предложен в качестве количественной оценки состояния фотосинтезирующих тканей растений.
Комбинированное и/или независимое использование ЛАМ и ХФ позволило разработать ряд новых способов экспресс-диагностики функционального состояния растительных организмов (восемь патентов России). Они получили общее название ЛАТ: лазерный анализ тканей. Оценка чувствительности ЛАТ проведена в сравнении с широко известным методом импульсной хлорофиллфлуориметрии ПАМ (Pulse Amplitude Modulation) [16] (рис.5).
Различные токсиканты при определенных дозах воздействия снижают как величину переменной флуоресценции, так и скорость изменения фотоиндуцированных процессов в хлоропластах. Но при этом использование комбинированного сигнала, полученного методом ЛАТ, позволяет выявить более тонкие различия в ответной реакции растений и при меньших действующих дозах, чем методом ПАМ (см. рис.5). К тому же с помощью ЛАТ можно оценивать состояние и не фотосинтезирующих тканей растений по степени упорядоченности их микроструктурной организации (рис.6). Таким образом, ЛАТ обладает большей чувствительностью и универсальностью, чем методы, построенные только на измерении хлорофиллфлуоресценции.
Разработанные способы экспресс-диагностики растений прошли испытание в ряде научных центров: Рейнском университете (Германия), ВНИИГиСПР, ВНИИС, ВННЦиСК (Россия) и показали свою пригодность для решения широкого круга научных и практических задач, например:
– исследование стрессоустойчивости и адаптивного потенциала растительных организмов;
– экологический мониторинг;
– оценка зрелости и товарного качества плодов и овощей;
– выбор условий хранения сельскохозяйственной продукции в предреализационный период;
– определение степени поражения растений вирусными и грибными заболеваниями;
– оптимизация минерального питания;
– минимизация норм применения пестицидов.
Для аппаратурной реализации описанных методов диагностики растений создано семейство лазерных приборов (рис.7), позволяющих работать как в лабораторных, так и полевых условиях. Они имеют общий принцип действия, но различаются по техническим характеристикам (см. табл.), функциональным возможностям и цене (от 200 до 2000 евро). Процесс измерения и регистрации данных полностью автоматизирован и управляется специально разработанной компьютерной программой. Питание устройств и передача информации происходит по USB-порту персонального компьютера.
Наиболее компактная и простая в эксплуатации модель – ЛАТ-2К (рис.8) предназначенная для массовых измерений. Ее возможности несколько ограничены: работает только в режиме пропускания зондирующего пучка. Однако малые габариты и масса (180 г) позволяют использовать это устройство в полевых условиях и проводить оперативные измерения in situ, т.е. на месте расположения объекта. Особенно удобен ЛАТ-2К для листовой диагностики.
Более универсальной является модель ЛАТ-3К (рис.9). Ее оптическая схема рассчитана на измерения как в режиме пропускания, так и отражения зондирующего лазерного пучка. В последнем случае размеры измеряемого объекта неограниченны. Это обеспечивает возможность тестирования качества плодов и овощей в процессе хранения и в предреализационный период. Сменные оптические модули позволяют работать с разными длинами волн зондирующего излучения.
ЛАТ-4КМ-Ст (рис.10) предназначен для научных исследований и может измерять как крупные, так и микроскопические биообъекты. Обладает высокой информационной емкостью (восемь диагностических показателей). Позволяет количественно оценивать микроструктурную организацию тканей и ее динамические перестройки, пригоден для тестирования биотехнологических объектов. Преимуществом прибора является возможность наблюдения измеряемой группы клеток на экране монитора ПК в течение измерений. Сменные модули дают возможность работать с различными длинами волн зондирующего излучения. Наличие подвижного стохастического экрана позволяет использовать ЛАТ 4КМ-Ст в качестве лазерного микроскопа высокого разрешения для наблюдения и компьютерной регистрации таких малых цитологических объектов, как хлоропласты и хромосомы.
Удивительно, что такое яркое в прямом и переносном смысле явление, как хлорофиллфлуоресценция, не обратило на себя внимание в исследованиях оптических свойств фотосинтезирующих тканей. Нам не известна ни одна работа и ни один прибор, в которых при измерении коэффициентов отражения или пропускания листьев учитывали двухкомпонентную природу регистрируемого сигнала. Возбуждение ХФ происходит практически во всем видимом диапазоне, а спектр ее излучения соответствует области чувствительности большинства применяемых фотоприемников. При этом, как было показано выше, интенсивность ХФ может весьма быстро изменяться во времени и значительно превосходить рассеянный зондирующий поток. Естественно, это приводит к значительной погрешности измерений.
В то же время парадоксальное на первый взгляд поведение регистрируемого сигнала, нестабильность его амплитудно-фазовых характеристик несут важную информацию о состоянии и функционировании живого организма. С одной стороны, это заставляет пересмотреть сложившиеся методические подходы к измерению оптических параметров фотосинтезирующих тканей. С другой, предоставляется возможность для разработки новых, более эффективных методов неразрушающей экспресс-диагностики растений.
Литература
1. Мерзляк М.Н., Погосян С.И. и др. Использование спектроскопии отражения в анализе пигментов высших растений. – Физиология растений. 2003, т. 50, № 5.
2. Будаговская О.Н. Оптическая дефектоскопия плодов. – Тамбов: Пролетарский Светоч, 2009.
3. Лазерное дистанционное зондирование растительности./Под ред. А. Румянцева. – Л., 1987
4. Беляев Б.И., Катковский Л.В. Оптическое дистанционное зондирование. – Минск: БГУ, 2006.
5. Бородин И.Ф., Будаговский А.В., Будаговская О.Н. и др. Применение эффекта фотоиндуцированной изменчивости оптических свойств хлорофиллсодержащих тканей для диагностики функционального состояния растений. –Доклады РАСХН, 2008, № 5.
6. Борен К., Хафмен К. Поглощение и рассеяние света малыми частицами. – М.: Мир, 1986.
7. Будаговская О.Н., Будаговский А.В., Будаговский И.А. Лазерная диагностика растений. – Мичуринск-наукоград РФ, 2010.
8. Budagovsky A., Budagovskaya O., Lenz.F. et al. Analysis of functional state of cultivated plants by means of interference of scattered light and chlorophyll fluorescence . –J. Applied Botany, 2002, v.76.
9. Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. В 3-х томах. – М.: Мир, 1994.
10. Hart J. Light and plant growth. – London: Unwin Hyman Ltd, 1988.
11. Брандт А.Б., Тагеева С.В. Оптические параметры растительных организмов. – М.: Наука, 1967.
12. Корнеев Д.Ю. Информационные возможности метода индукции флуоресценции хлорофилла. – К.: Альтерпрес, 2002.
13. Maxwell K., Johnson G.N. Chlorophyll fluorescence – a practical guide. – J. Exp. Bot., 2000, v.51, №345.
14. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. – М.: Наука, 1990.
15. Kautsky H., Franck U. Chlorophyllfluoreszenz und Kohlensaureassimilation. – Biochemische Zeitschrift., 1943, z. 315.
16. Portable fluorometer PAM-2000. Handbook of operation with examples of practical application. – Heinz Walz GmbH, 1993.
Зондирующий пучок квазимонохроматического, в частности, лазерного излучения, претерпевает сложные превращения при взаимодействии с растительной тканью. Если в ней есть клетки, содержащие зеленый пигмент хлорофилл, то наблюдаемые эффекты особенно интересны и носят, казалось бы, парадоксальный характер. Заключается это в сравнительно быстром спаде интенсивности и росте когерентности рассеянного зондирующего пучка в процессе измерений (рис.1). Уже в первые несколько секунд изменение оптических показателей как в режиме пропускания, так и отражения света (рис.2) достигает десятков процентов. Это легко регистрируется амплитудно-фазовым детектором с неселективным фотоприемником [5].
Рассмотрим, какие именно превращения испытывает лазерный луч в фотосинтезирующей ткани растений и как это можно использовать для практических целей. Пусть на живой зеленый лист падает квазимонохроматический пучок света интенсивностью I0 и длиной волны λ0 ± Δλ0. Из условия монохроматичности следует: Δλ0<<λ0. Часть света (RI0, где R – коэффициент отражения) отразится на границе раздела сред. Другая часть (AI0, где A – коэффициент поглощения) будет поглощена листом. Оставшаяся часть зондирующего потока (ТI0, где Т – коэффициент пропускания), претерпев рассеяние, выйдет за пределы листовой пластинки.
Поглощенный зелеными тканями растения свет частично диссипирует в тепло, частично расходуется на фотохимические реакции фотосинтеза, а частично высвечивается в виде хлорофиллфлуоресценции (ХФ). Ее спектр лежит в области 660–800 нм, с максимумами в районе 690 и 740 нм. В результате возникает комбинированный оптический сигнал, содержащий два типа излучений различной природы: рассеянный зондирующий пучок и индуцированная им флуоресценция хлорофилла.
К первому типу относятся отраженный RI0 и прошедший ТI0 пучки света. Они будут иметь тот же спектральный состав, что и зондирующий поток, однако их статистическая упорядоченность (когерентность) изменится. Это связано с оптической гетерогенностью растительной ткани и упругим рассеянием света на ее микронеоднородностях. В результате происходит уширение углового спектра лазерного пучка и снижение его радиуса корреляции. Речь идет о корреляции фаз в фотонном коллективе, радиус корреляции является характеристическим значением пространственной поперечной корреляционной функции световой волны, описывающей ее пространственную когерентность. Ткань растения в этом случае представляется в виде стохастического фазового экрана, параметры которого связаны с корреляционной функцией рассеянного излучения:
(1)
Фазовый экран – среда, в которой происходит изменение фаз фотонного коллектива, в стохастическом фазовом экране оптические неоднороности располагаются произвольно, не упорядочены, т.е. в определенной мере стохастизированы. В выражении (1) для Г (s) – комплексной степени пространственной когерентности – принято, что s – разность хода в поперечном сечении зондирующего пучка; a – ширина оптических неоднородностей; ω(h) – функция распределения неоднородностей фазового экрана по высоте h; λ – длина волны зондирующего излучения. Как видно из уравнения (1), степень когерентности рассеянного излучения определяется параметрами неоднородностей ткани и может служить мерой ее микроструктурной организации.
Амплитудные характеристики зондирующего излучения также представляют определенный интерес для анализа растений. Взаимодействуя с тканью, световая волна уменьшает свою интенсивность, что для случая однократного рассеяния может быть описано следующим выражением [6]:
I = I0e(-NabsCabsl)e(-NscaCscal), (2)
где I0 и I – интенсивность излучения до и после взаимодействия с объектом; l – длина оптического пути, Nabs и Cabs – концентрация и эффективное сечение поглощающих частиц; Nsca и Csca – концентрация и эффективное сечение рассеивающих частиц.
Измерение амплитудно-фазовых характеристик рассеянного зондирующего пучка позволяет дать количественную оценку функционального состояния растений. Такой метод диагностики получил название ЛАМ: лазерный анализ микроструктуры (тканей). Проведенные исследования показали, что действие различных дестабилизирующих факторов (физических, химических, биотических), нарушающих нормальное функционирование организма, обнаруживается по снижению статистической упорядоченности рассеянного излучения и изменению его интенсивности [7, 8]. Типичной иллюстрацией служит динамика патогенеза (заражения) растительной ткани (рис.3). В здоровой ткани (точка 1) когерентный пучок сильно поглощался, но сохранял значительную часть своей пространственной когерентности
(I ≈ 109; G ≈ 39%)*. Учитывая выбранную длину волны (632,8 нм), основным пигментом, поглощающим кванты света, можно считать хлорофилл. В латентной фазе развития инфекции (точка 2) концентрация хлорофилла оставалась неизменной, но стало заметно нарушение микроструктуры ткани. Пространственная когерентность рассеянного зондирующего пучка снизилась до 32%. Появление видимых симптомов заболевания (точка 3) сопровождалось дальнейшей стохастизацией (уменьшением когерентности) светового потока (G ≈ 23%) на фоне роста его интенсивности (I ≈ 163). Причина, вероятно, связана с нарушением структуры ткани и началом разрушения хлорофиллбелкового комплекса. При сильном развитии инфекции (точка 4) амплитудно-фазовые характеристики рассеянного зондирующего пучка претерпели двукратное изменение (I ≈ 204; G ≈ 16%).
Описанные процессы проходили сравнительно медленно, в течение десятков часов. Их можно считать квазистационарными. Однако свет способен вызвать и более динамичную конверсию (от лат. conversio изменение, превращение) оптических свойств растительной ткани, которая протекает за несколько десятков или даже единиц минут. Обусловлено это изменением формы, размеров и положения хлоропластов в клетке, движением цитоплазмы, а также фотодеструкцией хлорофилла [9, 10]. То есть, амплитудно-фазовые характеристики рассеянного растительной тканью света следует считать не постоянными, а медленно меняющимися и учитывать это при проведении измерений.
Вторым типом излучения, содержащегося в регистрируемом сигнале, является хлорофиллфлуоресценция. Она обладает низкой когерентностью вследствие отсутствия корреляции между элементарными актами испускания фотонов. Ее интенсивность F зависит от квантового выхода флуоресценции ϕF и числа поглощенных фотонов AI0, т.е.
F = ϕFAI0. В этом случае интенсивность света принято представлять в мкмоль фотонов умноженное на м-2с-1, где моль фотонов равен числу Авогадро. Для возбуждения ХФ целесообразно использовать свет, соответствующий спектральным максимумам поглощения хлорофилла. Например, зондирующее излучение полупроводникового лазера с длиной волны 650 нм поглощается листьями на 85–95% в зависимости от содержания в них зеленого пигмента [11]. У фотосинтезирующих тканей средний квантовый выход флуоресценции составляет 0,01–0,1 [12, 13]. Тогда интенсивность флуоресценции даже с учетом реабсорбции (вторичного поглощения) может достигать 3–5% от величины зондирующего потока I0. Вблизи λ0=650 нм коэффициенты пропускания и отражения листьев также составляет единицы процентов [1, 11]. Следовательно, интенсивности рассеянного зондирующего пучка с длиной волны λ0 и хлорофиллфлуоресценции в более длинноволновой области будут приблизительно равными.
Характерной особенностью ХФ является то, что ее квантовый выход зависит от интенсивности, а также длительности воздействия света и может изменяться в широких пределах. При низкой освещенности, когда практически все реакционные центры фотосистемы открыты, большая часть поглощенных квантов участвует в фотохимическом процессе и ХФ имеет минимальный уровень F0. При попадании на лист достаточно яркого (но не повреждающего) света, например, зондирующего пучка, происходит перенасыщение реакционных центров и они перестают выполнять фотосинтетическую функцию (закрываются). Избыток энергии возбуждения расходуется на флуоресценцию, которая достигает своего максимального значения Fm. Происходит так называемая быстрая фаза индукции флуоресценции хлорофилла (ИФХ). Относительный выход переменной флуоресценции: (Fm–Fo)/Fm характеризует эффективность первичных процессов фотосинтеза [12, 13]. Длительность переходного периода измеряется долями секунды. За это время интенсивность ХФ может возрасти в несколько раз и значительно превысить величину светового потока рассеянного излучения: RI0 или ТI0. Если зондирующий пучок и далее продолжает воздействовать на лист, начинается адаптация фотосинтетического аппарата клеток к интенсивному свету. Реакционные центры постепенно открываются, что приводит к снижению квантового выхода ХФ.
Это медленная фаза ИФХ, которая продолжается десятки
секунд [14].
Определяемая эффектом Каутского [15] (изменение интенсивности флюоресценции хлорофилла, происходящее под действием достаточно яркого света, отражает работу фотосинтетического аппарата клетки) кинетика ИФХ показывает состояние фотосинтетического аппарата клетки и служит важным диагностическим показателем. В то же время она усложняет оценку оптических свойств растительных тканей. Связано это с тем, что фотоприемники (фотодиоды, ФЭУ, CCD-камеры), которые обычно используют для измерения оптических потоков, обладают чувствительностью в широком диапазоне длин волн. Без специальных мер они не могут различать зондирующий поток и индуцированную им флуоресценцию хлорофилла. Неселективный фотодетектор зарегистрирует комбинированный световой сигнал, содержащий два компонента, различающихся по когерентности, спектральному диапазону и скорости изменения своей интенсивности. Именно такая картина представлена на рис.1. Спад интенсивности обусловлен снижением квантового выхода хлорофиллфлуоресценции в медленной фазе ИФХ. Эта же причина вызвала рост когерентности светового потока: в комбинированном сигнале уменьшился стохастический компонент, т.е. ХФ, а когерентный, полученный в результате упругого рассеяния зондирующего пучка, остался без значительных изменений.
Применение селективных фотоприемников позволяет провести независимую оценку микроструктурной организации ткани и ее фотосинтетической активности. Не меньший интерес представляет и прямое измерение комбинированного сигнала, содержащего когерентный и некогерентный (точнее, низкокогерентный) компоненты. Для экспресс-диагностики растительных организмов могут быть использованы амплитудно-фазовые (интенсивность и когерентность) характеристики такого излучения. Установлено, что чем больше величина и скорость их изменения, тем выше функциональная активность биологического объекта (рис.4). Аналитическое описание кинетических процессов удобно провести посредством аппроксимации рядов экспериментальных данных степенными уравнениями регрессии вида G(t); I(t) = Atb. Показатель степени b (динамический показатель) предложен в качестве количественной оценки состояния фотосинтезирующих тканей растений.
Комбинированное и/или независимое использование ЛАМ и ХФ позволило разработать ряд новых способов экспресс-диагностики функционального состояния растительных организмов (восемь патентов России). Они получили общее название ЛАТ: лазерный анализ тканей. Оценка чувствительности ЛАТ проведена в сравнении с широко известным методом импульсной хлорофиллфлуориметрии ПАМ (Pulse Amplitude Modulation) [16] (рис.5).
Различные токсиканты при определенных дозах воздействия снижают как величину переменной флуоресценции, так и скорость изменения фотоиндуцированных процессов в хлоропластах. Но при этом использование комбинированного сигнала, полученного методом ЛАТ, позволяет выявить более тонкие различия в ответной реакции растений и при меньших действующих дозах, чем методом ПАМ (см. рис.5). К тому же с помощью ЛАТ можно оценивать состояние и не фотосинтезирующих тканей растений по степени упорядоченности их микроструктурной организации (рис.6). Таким образом, ЛАТ обладает большей чувствительностью и универсальностью, чем методы, построенные только на измерении хлорофиллфлуоресценции.
Разработанные способы экспресс-диагностики растений прошли испытание в ряде научных центров: Рейнском университете (Германия), ВНИИГиСПР, ВНИИС, ВННЦиСК (Россия) и показали свою пригодность для решения широкого круга научных и практических задач, например:
– исследование стрессоустойчивости и адаптивного потенциала растительных организмов;
– экологический мониторинг;
– оценка зрелости и товарного качества плодов и овощей;
– выбор условий хранения сельскохозяйственной продукции в предреализационный период;
– определение степени поражения растений вирусными и грибными заболеваниями;
– оптимизация минерального питания;
– минимизация норм применения пестицидов.
Для аппаратурной реализации описанных методов диагностики растений создано семейство лазерных приборов (рис.7), позволяющих работать как в лабораторных, так и полевых условиях. Они имеют общий принцип действия, но различаются по техническим характеристикам (см. табл.), функциональным возможностям и цене (от 200 до 2000 евро). Процесс измерения и регистрации данных полностью автоматизирован и управляется специально разработанной компьютерной программой. Питание устройств и передача информации происходит по USB-порту персонального компьютера.
Наиболее компактная и простая в эксплуатации модель – ЛАТ-2К (рис.8) предназначенная для массовых измерений. Ее возможности несколько ограничены: работает только в режиме пропускания зондирующего пучка. Однако малые габариты и масса (180 г) позволяют использовать это устройство в полевых условиях и проводить оперативные измерения in situ, т.е. на месте расположения объекта. Особенно удобен ЛАТ-2К для листовой диагностики.
Более универсальной является модель ЛАТ-3К (рис.9). Ее оптическая схема рассчитана на измерения как в режиме пропускания, так и отражения зондирующего лазерного пучка. В последнем случае размеры измеряемого объекта неограниченны. Это обеспечивает возможность тестирования качества плодов и овощей в процессе хранения и в предреализационный период. Сменные оптические модули позволяют работать с разными длинами волн зондирующего излучения.
ЛАТ-4КМ-Ст (рис.10) предназначен для научных исследований и может измерять как крупные, так и микроскопические биообъекты. Обладает высокой информационной емкостью (восемь диагностических показателей). Позволяет количественно оценивать микроструктурную организацию тканей и ее динамические перестройки, пригоден для тестирования биотехнологических объектов. Преимуществом прибора является возможность наблюдения измеряемой группы клеток на экране монитора ПК в течение измерений. Сменные модули дают возможность работать с различными длинами волн зондирующего излучения. Наличие подвижного стохастического экрана позволяет использовать ЛАТ 4КМ-Ст в качестве лазерного микроскопа высокого разрешения для наблюдения и компьютерной регистрации таких малых цитологических объектов, как хлоропласты и хромосомы.
Удивительно, что такое яркое в прямом и переносном смысле явление, как хлорофиллфлуоресценция, не обратило на себя внимание в исследованиях оптических свойств фотосинтезирующих тканей. Нам не известна ни одна работа и ни один прибор, в которых при измерении коэффициентов отражения или пропускания листьев учитывали двухкомпонентную природу регистрируемого сигнала. Возбуждение ХФ происходит практически во всем видимом диапазоне, а спектр ее излучения соответствует области чувствительности большинства применяемых фотоприемников. При этом, как было показано выше, интенсивность ХФ может весьма быстро изменяться во времени и значительно превосходить рассеянный зондирующий поток. Естественно, это приводит к значительной погрешности измерений.
В то же время парадоксальное на первый взгляд поведение регистрируемого сигнала, нестабильность его амплитудно-фазовых характеристик несут важную информацию о состоянии и функционировании живого организма. С одной стороны, это заставляет пересмотреть сложившиеся методические подходы к измерению оптических параметров фотосинтезирующих тканей. С другой, предоставляется возможность для разработки новых, более эффективных методов неразрушающей экспресс-диагностики растений.
Литература
1. Мерзляк М.Н., Погосян С.И. и др. Использование спектроскопии отражения в анализе пигментов высших растений. – Физиология растений. 2003, т. 50, № 5.
2. Будаговская О.Н. Оптическая дефектоскопия плодов. – Тамбов: Пролетарский Светоч, 2009.
3. Лазерное дистанционное зондирование растительности./Под ред. А. Румянцева. – Л., 1987
4. Беляев Б.И., Катковский Л.В. Оптическое дистанционное зондирование. – Минск: БГУ, 2006.
5. Бородин И.Ф., Будаговский А.В., Будаговская О.Н. и др. Применение эффекта фотоиндуцированной изменчивости оптических свойств хлорофиллсодержащих тканей для диагностики функционального состояния растений. –Доклады РАСХН, 2008, № 5.
6. Борен К., Хафмен К. Поглощение и рассеяние света малыми частицами. – М.: Мир, 1986.
7. Будаговская О.Н., Будаговский А.В., Будаговский И.А. Лазерная диагностика растений. – Мичуринск-наукоград РФ, 2010.
8. Budagovsky A., Budagovskaya O., Lenz.F. et al. Analysis of functional state of cultivated plants by means of interference of scattered light and chlorophyll fluorescence . –J. Applied Botany, 2002, v.76.
9. Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. В 3-х томах. – М.: Мир, 1994.
10. Hart J. Light and plant growth. – London: Unwin Hyman Ltd, 1988.
11. Брандт А.Б., Тагеева С.В. Оптические параметры растительных организмов. – М.: Наука, 1967.
12. Корнеев Д.Ю. Информационные возможности метода индукции флуоресценции хлорофилла. – К.: Альтерпрес, 2002.
13. Maxwell K., Johnson G.N. Chlorophyll fluorescence – a practical guide. – J. Exp. Bot., 2000, v.51, №345.
14. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. – М.: Наука, 1990.
15. Kautsky H., Franck U. Chlorophyllfluoreszenz und Kohlensaureassimilation. – Biochemische Zeitschrift., 1943, z. 315.
16. Portable fluorometer PAM-2000. Handbook of operation with examples of practical application. – Heinz Walz GmbH, 1993.
Отзывы читателей
