eng
Выпуск #2/2011
Т.Гостев, Ф.Кузьминов, В.Фадеев, М.Горбунов
Биофотоника водных фотосинтезирующих организмов: флуоресцентные методы диагностики
Биофотоника водных фотосинтезирующих организмов: флуоресцентные методы диагностики
Просмотры: 3269
Водные фотосинтезирующие организмы (ФСО) играют важную роль в функционировании глобальной экосистемы. Они поставщики значительной доли кислорода на Земле. Актуальность мониторинга их физиологического состояния связана с возможностью влияния на него глобального изменения климата. Оптические методы в решении этой задачи занимают ведущее место. Рассмотрены два метода флуоресцентной диагностики водных ФСО, которые в сочетании позволяют достаточно полно описать их функциональное состояние.
Теги: aqueous photosynthesizing organisms fluorescent diagnostics: fluorescent induction and relaxation me nonlinear laser fluorimetry method водные фотосинтезирующие организмы метод индукции и релаксации флуоресценции метод нелинейной лазерной флуориметрии флуоресцентная диагностика
Изложен подход, основанный на комплексном применении двух современных, высокоинформативных методов флуоресцентной диагностики фотосинтезирующих организмов (ФСО) – метода индукции и релаксации флуоресценции и метода нелинейной лазерной флуориметрии – для наиболее полного описания функционального состояния фотосинтезирующих организмов. Описаны основные принципы этих методов, в частности алгоритм решения обратной задачи нелинейной флуориметрии, позволяющий определить до четырех фотофизических параметров молекул хлорофилла а (Хл а) in vivo. Возможности предложенного подхода проиллюстрированы на примере флуоресцентной диагностики состояния клеток различных классов водных ФСО (микроводорослей и цианобактерий), выращенных в условиях, отличающихся соленостью и содержанием азотного питания. Установлены существенные различия в степени влияния данных факторов среды на функциональное состояние исследованных классов ФСО, отражаемое фотофизическими параметрами.
Водные фотосинтезирующие организмы (главным образом, фитопланктон (ФП) – микроводоросли и цианобактерии) играют важную роль в функционировании глобальной экосистемы. Они являются первичным звеном трофической цепи, поставщиком значительной доли кислорода на Земле (по оценке [1] порядка 50% и более, в зависимости от сезона), “насосом”, откачивающим углекислый газ из атмосферы. Некоторые виды фотосинтезирующих организмов (цианобактерий) способны к фиксации атмосферного азота, делая его доступным для остальных организмов [2]. Это объясняет важность научной и прикладной задачи разработки новых методов исследования и мониторинга физиологического состояния ФП в среде его обитания, т.е. in situ. В последние годы ее актуальность возросла в связи с необходимостью контроля влияния глобального изменения климата на состояние биоты. Оптические методы в решении этой задачи занимают ведущее место, поскольку позволяют получать информацию в экспрессном и дистанционном режиме [3, 4]. Методы биофотоники широко используется в исследовании первичных процессов фотосинтеза, в частности связанных с ними механизмов оптического возбуждения основного пигмента фотосинтетической единицы – хлорофилла а (Хл а), химического и нефотохимического тушения его возбужденного состояния [5, 6].
Часть света, поглощенного клеткой фотосинтезирующего организма (ФСО), преобразуется в результате первичных процессов фотосинтеза в энергию химических связей и используется в дальнейшем для синтеза органических веществ. Некоторое количество энергии возбуждения молекул Хл а высвечивается в виде квантов флуоресценции [5, 7]. Эта особенность лежит в основе наиболее распространенных оптических методов исследования и контроля состояния фотосинтезирующих организмов, например – флуоресцентная спектроскопия ФСО при стационарном или динамически меняющемся оптическом возбуждении [4, 8].
Флуоресцентные методы исследования и контроля состояния ФСО условно можно разделить на два класса: а) методы, которые позволяют определить фотофизические параметры фотосинтетического аппарата (в частности, фотосистемы 2 (ФС 2) [5]) как целого, из которых наиболее современным и информативным является метод индукции и релаксации флуоресценции (Fluorescence Induction and Relaxation, FIRe [9]), и б) методы, позволяющие определить молекулярные фотофизические параметры отдельных флуорофоров (в частности, Хл а) в нативных ФСО, т. е. in vivo. К последним относится метод нелинейной лазерной флуориметрии (НЛФ) [4, 10].
В данной работе впервые изложен подход, основанный на комплексном применении методов FIRe и НЛФ для наиболее полной диагностики функционального состояния ФСО. Описаны основные принципы этих методов, в частности алгоритм решения обратной задачи нелинейной флуориметрии, позволяющий определить до четырех фотофизических параметров молекул Хл а [11].
Возможности развиваемого подхода иллюстрируются на примере флуоресцентной диагностики состояния клеток различных классов водных ФСО (микроводорослей и цианобактерий), выращенных в условиях, отличающихся соленостью и содержанием азотного питания. Предполагается, что индикатором их состояния может служить набор фотофизических параметров ФС 2 как целого и молекул Хл а, определяемый in vivo методами FIRe и НЛФ. Такой эксперимент имеет особый практический интерес, поскольку выбранные изменения характеристик среды наблюдаются в природе и, в частности, могут быть связаны с глобальным изменением климата.
МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ
НЕЛИНЕЙНАЯ ЛАЗЕРНАЯ ФЛУОРТМЕТРИЯ (НЛФ)
Максимум полосы флуоресценции зеленых микроводорослей находится на длине волны 685 нм, и соответствует флуоресценции хлорофилла а (рис.1а); в спектре флуоресценции цианобактерий добавляются полосы пигментов фикобиллинов (рис.1б) [12]. В отклике объема природной водной среды на оптическое возбуждение помимо флуоресценции ФП (в ряде случаев и других органических примесей природного и антропогенного происхождения [13]) присутствует полоса комбинационного рассеяния света (КР) молекулами воды (рис1а, б).
Нелинейная лазерная флуориметрия (НЛФ) [10] основана на регистрации нелинейной зависимости числа фотонов флуоресценции Nfl от плотности потока фотонов F возбуждающего лазерного излучения – кривой насыщения флуоресценции (рис.2).
Принципиальной особенностью ФСО как объекта флуориметрии является высокая локальная концентрация n0 молекул флуорофора (Хл а) в пигмент-белковом комплексе фотосинтетической единицы (n0=1019–1021см-3).
По этой причине насыщение флуоресценции при использовании для возбуждения наносекундных лазерных импульсов начинает проявляться уже при низких для таких лазеров значениях плотности потока фотонов F≈1020 см-2 . с-1 и связано, в первую очередь, с синглет-синглетной аннигиляцией [4] возбужденных состояний флуорофоров. При дальнейшем увеличении интенсивности возбуждающего излучения все бо’льшую роль в механизме насыщения флуоресценции начинает играть динамическое обеднение их основного состояния. Эти два процесса в основных чертах и влияют на форму кривой насыщения флуоресценции ФСО. Описывающие их параметры могут быть определены из экспериментальной кривой насыщения в результате решения обратной задачи с использованием принятой модели формирования флуоресцентного отклика флуорофоров на импульсное лазерное возбуждение с заданными параметрами [4].
В общем случае число параметров, описывающих два указанных фотофизических процесса в микроводорослях, достигает десяти, поскольку в фотосинтетическом аппарате присутствует целый ряд каналов возбуждения и релаксации возбужденного состояния молекул Хл а. В цианобактериях их еще больше [12]. Типичные кривые насыщения флуоресценции ФСО таковы, что обратная задача с таким большим числом определяемых параметров не может быть решена (является некорректной). Поэтому в [14] была предложена малопараметрическая модель, описывающая кривую насыщения флуоресценции ФСО как объекта с высокой локальной концентрацией флуорофоров. В модели фигурируют три обобщенных (в определенном смысле) фотофизических параметра: σ – сечение возбуждения молекул Хл a, учитывающее как прямое поглощение света этими молекулами, так и перенос энергии на них с молекул вспомогательных пигментов; τ – эффективное время жизни молекул Хл a, учитывающее все процессы дезактивации возбужденного состояния, кроме синглет-синглетной аннигиляции; γ . n0 – максимальная скорость синглет-синглетной аннигиляции (γ– константа скорости, n0 — локальная концентрация молекул Хл а в фотосинтетической единице).
Для населенности n первого возбужденного синглетного состояния молекул Хл а в рамках этой модели можно написать следующее кинетическое уравнение:
(1)
Число фотонов флуоресценции из возбуждаемого объема среды дается выражением:
, (2)
здесь kfl – скорость излучательного распада возбужденного состояния флуорофора, – решение уравнения (1), – радиус-вектор в поперечном сечении лазерного пучка, z – координата вдоль направления распространения лазерного импульса, V – объем, из которого принимается сигнал флуоресценции. Отметим, что зависимостью плотности потока фотонов возбуждающего излучения F от координаты z можно пренебречь, поскольку в реальном эксперименте концентрация микроводорослей мала, и ослабление лазерного излучения можно не учитывать (приближение оптически тонкого слоя).
В эксперименте, как правило, измеряется зависимость относительного числа фотонов флуоресценции Nfl от плотности потока фотонов F возбуждающего лазерного излучения. Для перехода к величинам, которые можно измерить в абсолютных единицах, необходимо произвести нормировку числа регистрируемых квантов флуоресценции Nfl на некоторый реперный сигнал Nr, линейно зависящий от плотности потока фотонов возбуждающего излучения. Наибольшая точность такой нормировки достигается, когда в качестве реперного используется сигнал КР воды, который возбуждается тем же излучением, что и флуоресценция ФП и излучается из того же объема среды (см. рис.1) [15]. В случае, когда отсутствует одновременная регистрация полос КР воды и флуоресценции ФП (как это имело место в данной работе), в качестве реперного может быть использован сигнал в опорном канале, регистрирующем небольшую часть энергии, отводимую из лазерного пучка (см. ниже). Отношение Ф=Nfl/Nr будем, следуя [10], называть флуоресцентным параметром, а зависимость Ф-1(F) – кривой насыщения флуоресценции. Флуоресцентный параметр в отсутствие насыщения – “ненасыщенный флуоресцентный параметр” (Ф0) – связан с Ф(F) формулой:
Ф0 = Ф(F).
В работе [16] было показано, что при значениях плотности потока фотонов возбуждающего излучения, соответствующих начальному участку кривой насыщения флуоресценции (F≈1019–1023 см-2 . с-1),
доминирующим механизмом нелинейности является синглет-синглетная аннигиляция, а динамическое обеднение основного состояния еще не проявляется. В результате ход кривой насыщения на этом участке определяется двумя параметрами – ненасыщенным флуоресцентным параметром Ф0 и параметром насыщения A=σ . τ2 . γ . n0. Кривую насыщения удается описать приближенным аналитическим выражением (3), если реализуется квазистационарный режим возбуждения, когда длительность лазерного импульса на порядок больше характерных значений времени дезактивации возбужденных состояний молекул Хл а, которые составляют порядка 1 нс [17]:
, (3)
здесь αi – рассчитанные числовые коэффициенты, зависящие от пространственно временного распределения интенсивности лазерного излучения (коэффициенты α1 и α2 удовлетворяют условию , что следует из определения параметра Ф0).
В [18] показана высокая чувствительность параметра насыщения к видовой принадлежности ФСО (изменению состава вспомогательных пигментов) и состоянию фотосинтетического аппарата, однако выделить индивидуальный вклад каждого фотофизического параметра модели (1) в его изменение не представлялось возможным. Это ограничивало применимость метода для исследования фотофизических процессов в ФСО и диагностики состояния фотосинтетического аппарата.
В работе [11] нами был предложен двухэтапный алгоритм, основанный на априорной информации, которая следует из анализа фотофизических процессов в системах с высокой локальной концентрацией флуорофоров, и позволяющий с достаточно высокой точностью раздельно определять все фотофизические параметры Хл а, фигурирующие в модели (1).
Для этого измеряется кривая насыщения флуоресценции с использованием лазерных импульсов длительностью более 10 нс (квазистационарный режим возбуждения), но в значительно более широком диапазоне изменения значений плотности потока фотонов (F=1021–1025 см-2 . с-1), чем это делалось в [18].
На начальном участке кривой насыщения (F=1021–8 . 1023 см-2 . с-1) динамическое обеднение основного состояния выражено слабо, им можно пренебречь и обрабатывать кривую насыщения с использованием квазистационарного приближения по формуле (3); при этом определяются значения параметров Ф0 и A=σ . τ2 . γ . n0. Зафиксировав эти значения, численно решаем двухпараметрическую обратную задачу с использованием всей кривой насыщения флуоресценции. Определяемыми параметрами на этом, втором этапе являются: обобщенное время дезактивации возбужденного состояния τ и сечение возбуждения σ. Далее, используя найденное на первом этапе значение
параметра A, вычисляем параметр γ . n0.
Описанный алгоритм подробно теоретически исследован в работе [11]. Методами численного моделирования показано, что при уровне шумов до 5%, что достижимо в реальном эксперименте, ошибка определения фотофизических параметров не превышает 20%. Это является приемлемым для ряда применений, особенно в тех случаях, когда используются не абсолютные значения параметров, а их изменение под действием тех или иных факторов.
Для реализации описанного алгоритма был разработан лазерный спектрометр на базе излучателя с активными элементами из ИАГ:Nd3+, генерирующий 25-нс импульсы на основной длине волны 1064 нм с преобразованием во вторую гармонику (длина волны 532 нм), энергия в импульсе которой плавно менялась от нуля до максимального значения 12 мДж с помощью ячейки Поккельса.
Для регистрации сигнала флуоресценции использовался фотоэлектронный умножитель (Hamamatsu) с повышенной чувствительностью в красной области спектра. Спектральная селекция осуществлялась узкополосным фильтром с максимумом пропускания на длине волны 685 нм, что соответствует положению максимума полосы флуоресценции Хл а. При использованной в наших экспериментах концентрации водорослей вкладом полосы КР воды (длина волны максимума 651 нм, ширина на полувысоте 20 нм) в регистрируемый сигнал можно было пренебречь.
Нормировка сигнала флуоресценции осуществлялась на сигнал в реперном канале, пропорциональный интенсивности лазерного излучения. В качестве детектора реперного канала использовался PIN-фотодиод со встроенным предусилителем (Hamamatsu). Аналогичный детектор использовали и в системе запуска аналого-цифрового преобразователя (АЦП).
Для оцифровки сигналов с детекторов применены два многофункциональных устройства ввода-вывода данных (National Instruments) c 16-битными АЦП. С учетом шумов и нелинейности детекторов система регистрации обеспечивает эффективный динамический диапазон порядка 5000 единиц, что позволяет регистрировать кривую насыщения флуоресценции микроводорослей в диапазоне изменения плотности потока фотонов возбуждающего излучения F=6·1021–3 . 1025 см-2 . с-1.
Метод индукции
и релаксации
флуоресценции (FIRe)
Метод FIRe [9] основан на регистрации с высоким временным разрешением (масштаб времени от 1 мкс) кривой индукции и последующей релаксации флуоресценции молекул Хл а, возбуждаемой короткими импульсами света длительностью от 0,5 мкс и пиковой мощностью до 1 Вт/см2 (рис.3).
Типичный протокол измерения фотофизических параметров с помощью метода FIRe состоит из четырех этапов. На первом этапе для возбуждения флуоресценции используется одиночный мощный импульс света длительностью порядка 100 мкс, переводящий все реакционные центры (РЦ) фотосинтетического аппарата (РЦ –белковые комплексы, использующие поглощенную солнечную энергию для разделения зарядов [5] ) в закрытое состояние, когда эффективный перенос энергии с молекул Хл а светособирающей антенны на РЦ прекращается. При этом за время импульса интенсивность флуоресценции возрастает от своего минимального значения F0 до максимального значения FM.
На втором этапе длительностью порядка 500 мс регистрируется релаксация флуоресценции, характеризующая постепенное открытие РЦ. Для этого используется специальная последовательность импульсов, при которой их действие на состояние РЦ сведено к минимуму и учитывается при обработке кривых релаксации.
На третьем этапе для возбуждения флуоресценции используется длинный импульс света (длительность порядка 50 мс) с высокой пиковой мощностью, который не только переводит все РЦ в закрытое состояние, но и влияет на ряд других участков цепи миграции зарядов в фотосинтетическом аппарате. На этом участке интенсивность флуоресценции достигает своего максимального значения F′M, отличающегося, вообще говоря, от значения FM.
На четвертом этапе регистрируется релаксация флуоресценции до уровня F′0.
Определенные на описанных этапах значения интенсивности флуоресценции, а также времена, за которые достигаются максимальные значения FM и F′M (скорости индукции), и минимальные значения F0 и F′0 (скорости релаксации), используются для расчета ряда фотофизических параметров, которые характеризуют функциональное состояние фотосинтетического аппарата. К таким параметрам относятся: переменная флуоресценция FV = FM – F0; показатель фотосинтетической активности FV/FM, характеризующий относительное количество изначально открытых (фотосинтетически активных) РЦ, участвующих в разделении зарядов; эффективное сечение фотохимического разделения зарядов σPS2, характеризующее вероятность разделения зарядов в РЦ при попадании на фотосинтетический аппарат одного фотона; скорости релаксации флуоресценции на 2-м этапе τ-1Qa, характеризующие восстановление реакционных центров до открытого состояния (времена переноса электрона между первичным и вторичным акцепторами в цепи транспорта электронов); коэффициент нефотохимического тушения nq, характеризующий эффективность фотопротекторных механизмов (нефотохимического тушения возбужденных состояний пигментов – хлорофилла а в водорослях, аллофикоцианина в цианобактериях [19]).
В качестве источников света в FIRe-флуориметре используются мощные светодиоды с длиной волны излучения 470 нм и 590 нм (ширина полосы излучения по полувысоте – 20 нм), которые попадают в полосы поглощения молекул Хл а и/или других светособирающих пигментов. Сигнал флуоресценции регистрируется лавинным фотодиодом и оцифровывается 12-битным АЦП с частотой порядка 1 МГц. Спектральная селекция сигнала флуоресценции осуществляется узкополосным фильтром с максимум полосы пропускания на длине волны 685 нм. Небольшая часть возбуждающего излучения направляется отводной пластинкой на PIN-фотодиод реперного канала.
Объекты
В рамках апробации подхода, основанного на комплексном применении методов FIRe и НЛФ для наиболее полной диагностики функционального состояния ФСО, были проведены эксперименты по определению набора фотофизических параметров трех классов водных ФСО, выращенных в разных условиях. В качестве тестовых объектов были выбраны чистые культуры следующих ФСО: диатомовой микроводоросли Thalassiosira weissflogii, зооксантелл Symbiodium sp. CCMP 2467 и цианобактерий Synechococcus sp. CCMP 1379. Каждый из выбранных объектов был разделен на несколько групп: контрольную, выращенную при стандартных для данного объекта условиях среды, и группы, выращенные при различных уровнях солености (40, 18 и 5‰*) и азотного питания (норма – 1N; в два раза выше нормы – 2N; в два раза ниже нормы – 0,5N).
РЕЗУЛЬТАТЫ
И ОБСУЖДЕНИЕ
Значения фотофизических параметров выбранных объектов, определенные методом нелинейной лазерной флуориметрии из экспериментальных кривых насыщения, приведены в табл.1. Полученные результаты показывают достаточно высокую чувствительность диатомовых водорослей к изменению солености питательной среды (для этих водорослей близкой к нормальной является соленость 18‰), при этом изменение уровня азотного питания в четыре раза более слабо сказалось на значении фотофизических параметров, за исключением возросшего времени дезактивации возбужденного состояния молекул Хл а τ в случае увеличения азотного питания в два раза относительно стандартной среды. Это может быть связано с уменьшением скорости переноса энергии на реакционный центр (вероятности фотохимического тушения). В работе [20] это связывают с уменьшением доли фотосинтетически активных реакционных центров при увеличении содержания азота в среде.
Отклонение солености от нормального для данной водоросли значения 18‰ (как в сторону увеличения, так и уменьшения) вызывает значительное увеличение как параметра насыщения A, так и времени дезактивации τ. Это говорит о серьезном ингибировании у данных объектов первичных реакций фотосинтеза.
Кроме того, описанные изменения в среде привели к незначительному уменьшению максимальной скорости синглет-синглетной аннигиляции γ . n0, что может быть связано с влиянием их на локальную концентрацию молекул Хл а.
Еще большей чувствительностью к изменениям в окружающей среде обладают зооксантеллы – водоросли, живущие в тканях коралловых полипов. Уменьшение содержания азотного питания в два раза приводит к заметному ингибированию фотосинтетической активности клеток. Вариация солености питательной среды (нормальной для этой водоросли является соленость 40‰) существенно уменьшает значение параметра Ф0, который в первом приближении пропорционален концентрации клеток, тщ есть снижает скорость деления клеток. Это в совокупности с увеличением параметра насыщения A свидетельствует о сильном ингибировании фотосинтеза.
Значения фотофизических параметров выбранных объектов, определенные методом FIRe, приведены в табл.2.
Полученные с помощью метода индукции и релаксации флуоресценции значения фотофизических параметров ФС 2 как целого – эффективного сечения и фотосинтетической активности – для диатомовой водоросли не зависят в пределах погрешности от величины солености и содержания азота в среде. Единственным параметром, чувствительным к изменениям характеристик среды, оказалось время, характеризующее перенос электрона между первичным и вторичным акцептором электронов (и, соответственно, динамику открытия РЦ). Наблюдается увеличение этого параметра для культуры, выращенной в условиях повышенного содержания азота. Это означает появление нарушений в цепи электронного транспорта и согласуется с данными нелинейной флуориметрии, поскольку, несмотря на принципиальное различие параметров τ, определяемого методом нелинейной флуориметрии, и τ0, восстанавливаемого из кривой релаксации флуоресценции, они так или иначе отражают изменение состояния, в котором находятся РЦ, и в общем случае увеличение этих времен говорит о неких нарушениях в работе РЦ. Увеличение параметра τQa имеет место и при изменении солености (относительно нормального для данной водоросли значения 18‰), однако эти изменения не так значительны. Этот результат также согласуется с данными нелинейной флуориметрии.
Подчеркнем еще раз тот факт, что эффективное сечение фотосистемы 2 для всех образцов оставалось постоянным, а в случае нелинейной флуориметрии наблюдались хотя и незначительные, но вполне обнаружимые вариации сечения поглощения молекул Хл а. Сечения, определяемые обоими методами, в первом приближении связаны между собой, поскольку эффективное сечение фотосистемы 2 есть произведение суммарного сечения поглощения всех молекул Хл а фотосистемы 2 на эффективность разделения зарядов в РЦ. Это объясняет тот факт, что данные параметры, определенные для диатомовой водоросли с помощью различных методик, зависят от внешних факторов в целом синхронно, хотя и не полностью идентично.
В случае зооксантелл изменения наблюдали в основном для образца с минимальной соленостью: происходит значительное уменьшение фотосинтетической активности и сечения σPS2, а время электронного транспорта τQa увеличивается. Это свидетельствует о гибели данной культуры вследствие неспособности адаптироваться к среде со столь низкой соленостью. Для других образцов отметим следующие изменения: незначительные уменьшения фотосинтетической активности для образцов, выращенных в условиях пониженной солености (18‰) и при увеличенном содержании азота в среде; уменьшение коэффициента нефотохимического тушения для образца с двойным содержанием азота; незначительное увеличение времен электронного транспорта для культур с пониженным содержанием азота в среде и низкой концентрацией солей.
Для цианобактерий (нормальной для них является соленость 40‰) изменение солености сказалось в первую очередь на изменениях в коэффициенте нефотохимического тушения. Более низкий уровень солености приводит к уменьшению эффективности механизмов нефотохимического тушения, при этом остальные параметры не претерпевают значительных изменений. Можно предположить, что изменение солености в среде приводит к изменению внутриклеточных характеристик (например, вязкости), что изменяет процессы, связанные с диссипацией избыточной энергии.
Изменение минерального питания (как его увеличение, так и его уменьшение) отражается прежде всего на времени электронного транспорта между первичным и вторичным донором электронов τQa – происходит незначительное уменьшение этого параметра.
Сравнительный анализ зависимостей фотофизических параметров, измеренных методами FIRe и НЛФ, позволяет заключить, что эти параметры в целом изменяются синхронно при изменениях солености и концентрации азота, но с разной производной, тем самым дополняя друг друга и увеличивая избирательность при определении влияния того или иного фактора среды.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Показана возможность использования набора фотофизических параметров водных фотосинтезирующих организмов (микроводорослей и цианобактерий) – параметров ФС 2 как целого (определяемых методом индукции и релаксации флуоресценции, FIRe) и Хл а in vivo (определяемых методом нелинейной лазерной флуориметрии, НЛФ) – для диагностики изменения их физиологического состояния при изменении факторов среды (на примере изменений солености и концентрации азота, моделирующих вариацию этих факторов в акваториях Мирового океана как следствие глобального изменения климата). Обнаружено синхронное, в целом, поведение этих групп параметров, однако в характере их изменения имеются различия, увеличивающие диагностические возможности комплексного метода, использующего полный набор параметров, по сравнению с раздельным применением каждого из указанных методов флуориметрии ФСО.
Установлены различия в степени влияния указанных факторов среды на физиологическое состояние разных групп водных ФСО (диатомовых водорослей, зооксантелл и цианобактерий), отражаемое фотофизическими параметрами.
Наиболее устойчивыми к изменениям среды оказались цианобактерии, а наиболее чувствительными – зооксантеллы. Это заставляет предположить, что одним из результатов влияния глобального изменения климата на водные экосистемы будет трансформация видовой структуры фитопланктонного сообщества в сторону возрастания роли цианобактерий (отметим, что отдельные виды цианобактерий токсичны). Еще один тревожный прогноз – негативное влияние глобального изменения климата на физиологическое состояние кораллов, в симбиозе с которыми находятся зооксантеллы. Это наводит на мысль, что причинами отмечаемого повсеместно ухудшения состояния коралловых рифов являются не только антропогенные факторы, но и климатические, и означает, что флуоресцентный мониторинг коралловых рифов с определением фотофизических характеристик зооксантелл может быть одним из наиболее эффективных средств обнаружения влияния глобального изменения климата на морскую биоту на его ранних стадиях.
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ и CRDF (№ 09–05–92515–ИК и № RUG1–2952–MO–09). Авторы благодарят Е.Н. Воронову (Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова) за подготовку препаратов водорослей и цианобактерий, выращенных при разных значениях солености и концентрации азота.
Литература
1. Wood J., Tett P., Edwards A. – Journal of Ecology, 1973, 61, 569.
2. Flore C., Jarett J., Olson N., Lesser M. – Trends in Microbiology, 2010,18, 455.
3. Hoge F., Swift R. – Applied Optics, 1983,22, 2271.
4. Фадеев В., Бунин Д., Венедиктов П. – Квантовая электроника, 1996, 23, 963.
5. Говинджи Д., Уитмарш Дж. Фотосинтез. – М: Мир, 1987.
6. Laisk A., Oja V., Rasulov B. et al. – Plant Physiology, 1997,115, 803 .
7. Maxwell K., Johnson G. – Journal of Experimental Botany, 2000, 51, 659.
8. Joshi M., Mohanty P. – Journal of Scientific and Industrial Research, 1995, 54, 155.
9. Gorbunov M., Falkowski P. In Proceedings of XIII International Congress of Photosynthesis (Montreal: Allen Press, 2004, p. 1029).
10. Фадеев В. Вестник Московского университета. Серия 3. Физика. Астрономия, 1998, 4, 49.
11. Гостев Т., Фадеев В. – Квантовая электроника, 2011 (в печати).
12. Fork D., Mohanty P. In Light Emission by Plants and Bacteria. –London: Academic Press, 1986, p. 451.
13. Фадеев В. В. Физические проблемы экологии (экологическая физика). – М: Изд–во физфак МГУ, 1999.
14. Маслов Д., Фадеев В., Литвинов П. Вестник Московского университета Сер. 3. Физика. Астрономия, 2002, 1, 34.
15. Клышко Д., Фадеев В. – Доклады АН СССР, 1978, с.238,
320.
16. Маслов Д., Остроумов Е., Фадеев В. – Квантовая электроника, 2006, 36, 163.
17. Paschenko V., Kononenko A., Protasov S. et al. – Biochimica Et Biophysica Acta, 1977, 461, 403.
18. Маслов Д., Ильяш Л., Остроумов Е., Погосян С. и др. – Биофизика, 2005, 50, 843.
19. Vredenberg W., Durchan M., Prasil O. – Biochimica Et Biophysica Acta, 2009,1787, 1468.
20. Shangguan Z., Shao M., Dyckmans J. – Journal of Plant Physiology, 2000,156, 46.
Водные фотосинтезирующие организмы (главным образом, фитопланктон (ФП) – микроводоросли и цианобактерии) играют важную роль в функционировании глобальной экосистемы. Они являются первичным звеном трофической цепи, поставщиком значительной доли кислорода на Земле (по оценке [1] порядка 50% и более, в зависимости от сезона), “насосом”, откачивающим углекислый газ из атмосферы. Некоторые виды фотосинтезирующих организмов (цианобактерий) способны к фиксации атмосферного азота, делая его доступным для остальных организмов [2]. Это объясняет важность научной и прикладной задачи разработки новых методов исследования и мониторинга физиологического состояния ФП в среде его обитания, т.е. in situ. В последние годы ее актуальность возросла в связи с необходимостью контроля влияния глобального изменения климата на состояние биоты. Оптические методы в решении этой задачи занимают ведущее место, поскольку позволяют получать информацию в экспрессном и дистанционном режиме [3, 4]. Методы биофотоники широко используется в исследовании первичных процессов фотосинтеза, в частности связанных с ними механизмов оптического возбуждения основного пигмента фотосинтетической единицы – хлорофилла а (Хл а), химического и нефотохимического тушения его возбужденного состояния [5, 6].
Часть света, поглощенного клеткой фотосинтезирующего организма (ФСО), преобразуется в результате первичных процессов фотосинтеза в энергию химических связей и используется в дальнейшем для синтеза органических веществ. Некоторое количество энергии возбуждения молекул Хл а высвечивается в виде квантов флуоресценции [5, 7]. Эта особенность лежит в основе наиболее распространенных оптических методов исследования и контроля состояния фотосинтезирующих организмов, например – флуоресцентная спектроскопия ФСО при стационарном или динамически меняющемся оптическом возбуждении [4, 8].
Флуоресцентные методы исследования и контроля состояния ФСО условно можно разделить на два класса: а) методы, которые позволяют определить фотофизические параметры фотосинтетического аппарата (в частности, фотосистемы 2 (ФС 2) [5]) как целого, из которых наиболее современным и информативным является метод индукции и релаксации флуоресценции (Fluorescence Induction and Relaxation, FIRe [9]), и б) методы, позволяющие определить молекулярные фотофизические параметры отдельных флуорофоров (в частности, Хл а) в нативных ФСО, т. е. in vivo. К последним относится метод нелинейной лазерной флуориметрии (НЛФ) [4, 10].
В данной работе впервые изложен подход, основанный на комплексном применении методов FIRe и НЛФ для наиболее полной диагностики функционального состояния ФСО. Описаны основные принципы этих методов, в частности алгоритм решения обратной задачи нелинейной флуориметрии, позволяющий определить до четырех фотофизических параметров молекул Хл а [11].
Возможности развиваемого подхода иллюстрируются на примере флуоресцентной диагностики состояния клеток различных классов водных ФСО (микроводорослей и цианобактерий), выращенных в условиях, отличающихся соленостью и содержанием азотного питания. Предполагается, что индикатором их состояния может служить набор фотофизических параметров ФС 2 как целого и молекул Хл а, определяемый in vivo методами FIRe и НЛФ. Такой эксперимент имеет особый практический интерес, поскольку выбранные изменения характеристик среды наблюдаются в природе и, в частности, могут быть связаны с глобальным изменением климата.
МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ
НЕЛИНЕЙНАЯ ЛАЗЕРНАЯ ФЛУОРТМЕТРИЯ (НЛФ)
Максимум полосы флуоресценции зеленых микроводорослей находится на длине волны 685 нм, и соответствует флуоресценции хлорофилла а (рис.1а); в спектре флуоресценции цианобактерий добавляются полосы пигментов фикобиллинов (рис.1б) [12]. В отклике объема природной водной среды на оптическое возбуждение помимо флуоресценции ФП (в ряде случаев и других органических примесей природного и антропогенного происхождения [13]) присутствует полоса комбинационного рассеяния света (КР) молекулами воды (рис1а, б).
Нелинейная лазерная флуориметрия (НЛФ) [10] основана на регистрации нелинейной зависимости числа фотонов флуоресценции Nfl от плотности потока фотонов F возбуждающего лазерного излучения – кривой насыщения флуоресценции (рис.2).
Принципиальной особенностью ФСО как объекта флуориметрии является высокая локальная концентрация n0 молекул флуорофора (Хл а) в пигмент-белковом комплексе фотосинтетической единицы (n0=1019–1021см-3).
По этой причине насыщение флуоресценции при использовании для возбуждения наносекундных лазерных импульсов начинает проявляться уже при низких для таких лазеров значениях плотности потока фотонов F≈1020 см-2 . с-1 и связано, в первую очередь, с синглет-синглетной аннигиляцией [4] возбужденных состояний флуорофоров. При дальнейшем увеличении интенсивности возбуждающего излучения все бо’льшую роль в механизме насыщения флуоресценции начинает играть динамическое обеднение их основного состояния. Эти два процесса в основных чертах и влияют на форму кривой насыщения флуоресценции ФСО. Описывающие их параметры могут быть определены из экспериментальной кривой насыщения в результате решения обратной задачи с использованием принятой модели формирования флуоресцентного отклика флуорофоров на импульсное лазерное возбуждение с заданными параметрами [4].
В общем случае число параметров, описывающих два указанных фотофизических процесса в микроводорослях, достигает десяти, поскольку в фотосинтетическом аппарате присутствует целый ряд каналов возбуждения и релаксации возбужденного состояния молекул Хл а. В цианобактериях их еще больше [12]. Типичные кривые насыщения флуоресценции ФСО таковы, что обратная задача с таким большим числом определяемых параметров не может быть решена (является некорректной). Поэтому в [14] была предложена малопараметрическая модель, описывающая кривую насыщения флуоресценции ФСО как объекта с высокой локальной концентрацией флуорофоров. В модели фигурируют три обобщенных (в определенном смысле) фотофизических параметра: σ – сечение возбуждения молекул Хл a, учитывающее как прямое поглощение света этими молекулами, так и перенос энергии на них с молекул вспомогательных пигментов; τ – эффективное время жизни молекул Хл a, учитывающее все процессы дезактивации возбужденного состояния, кроме синглет-синглетной аннигиляции; γ . n0 – максимальная скорость синглет-синглетной аннигиляции (γ– константа скорости, n0 — локальная концентрация молекул Хл а в фотосинтетической единице).
Для населенности n первого возбужденного синглетного состояния молекул Хл а в рамках этой модели можно написать следующее кинетическое уравнение:
(1)
Число фотонов флуоресценции из возбуждаемого объема среды дается выражением:
, (2)
здесь kfl – скорость излучательного распада возбужденного состояния флуорофора, – решение уравнения (1), – радиус-вектор в поперечном сечении лазерного пучка, z – координата вдоль направления распространения лазерного импульса, V – объем, из которого принимается сигнал флуоресценции. Отметим, что зависимостью плотности потока фотонов возбуждающего излучения F от координаты z можно пренебречь, поскольку в реальном эксперименте концентрация микроводорослей мала, и ослабление лазерного излучения можно не учитывать (приближение оптически тонкого слоя).
В эксперименте, как правило, измеряется зависимость относительного числа фотонов флуоресценции Nfl от плотности потока фотонов F возбуждающего лазерного излучения. Для перехода к величинам, которые можно измерить в абсолютных единицах, необходимо произвести нормировку числа регистрируемых квантов флуоресценции Nfl на некоторый реперный сигнал Nr, линейно зависящий от плотности потока фотонов возбуждающего излучения. Наибольшая точность такой нормировки достигается, когда в качестве реперного используется сигнал КР воды, который возбуждается тем же излучением, что и флуоресценция ФП и излучается из того же объема среды (см. рис.1) [15]. В случае, когда отсутствует одновременная регистрация полос КР воды и флуоресценции ФП (как это имело место в данной работе), в качестве реперного может быть использован сигнал в опорном канале, регистрирующем небольшую часть энергии, отводимую из лазерного пучка (см. ниже). Отношение Ф=Nfl/Nr будем, следуя [10], называть флуоресцентным параметром, а зависимость Ф-1(F) – кривой насыщения флуоресценции. Флуоресцентный параметр в отсутствие насыщения – “ненасыщенный флуоресцентный параметр” (Ф0) – связан с Ф(F) формулой:
Ф0 = Ф(F).
В работе [16] было показано, что при значениях плотности потока фотонов возбуждающего излучения, соответствующих начальному участку кривой насыщения флуоресценции (F≈1019–1023 см-2 . с-1),
доминирующим механизмом нелинейности является синглет-синглетная аннигиляция, а динамическое обеднение основного состояния еще не проявляется. В результате ход кривой насыщения на этом участке определяется двумя параметрами – ненасыщенным флуоресцентным параметром Ф0 и параметром насыщения A=σ . τ2 . γ . n0. Кривую насыщения удается описать приближенным аналитическим выражением (3), если реализуется квазистационарный режим возбуждения, когда длительность лазерного импульса на порядок больше характерных значений времени дезактивации возбужденных состояний молекул Хл а, которые составляют порядка 1 нс [17]:
, (3)
здесь αi – рассчитанные числовые коэффициенты, зависящие от пространственно временного распределения интенсивности лазерного излучения (коэффициенты α1 и α2 удовлетворяют условию , что следует из определения параметра Ф0).
В [18] показана высокая чувствительность параметра насыщения к видовой принадлежности ФСО (изменению состава вспомогательных пигментов) и состоянию фотосинтетического аппарата, однако выделить индивидуальный вклад каждого фотофизического параметра модели (1) в его изменение не представлялось возможным. Это ограничивало применимость метода для исследования фотофизических процессов в ФСО и диагностики состояния фотосинтетического аппарата.
В работе [11] нами был предложен двухэтапный алгоритм, основанный на априорной информации, которая следует из анализа фотофизических процессов в системах с высокой локальной концентрацией флуорофоров, и позволяющий с достаточно высокой точностью раздельно определять все фотофизические параметры Хл а, фигурирующие в модели (1).
Для этого измеряется кривая насыщения флуоресценции с использованием лазерных импульсов длительностью более 10 нс (квазистационарный режим возбуждения), но в значительно более широком диапазоне изменения значений плотности потока фотонов (F=1021–1025 см-2 . с-1), чем это делалось в [18].
На начальном участке кривой насыщения (F=1021–8 . 1023 см-2 . с-1) динамическое обеднение основного состояния выражено слабо, им можно пренебречь и обрабатывать кривую насыщения с использованием квазистационарного приближения по формуле (3); при этом определяются значения параметров Ф0 и A=σ . τ2 . γ . n0. Зафиксировав эти значения, численно решаем двухпараметрическую обратную задачу с использованием всей кривой насыщения флуоресценции. Определяемыми параметрами на этом, втором этапе являются: обобщенное время дезактивации возбужденного состояния τ и сечение возбуждения σ. Далее, используя найденное на первом этапе значение
параметра A, вычисляем параметр γ . n0.
Описанный алгоритм подробно теоретически исследован в работе [11]. Методами численного моделирования показано, что при уровне шумов до 5%, что достижимо в реальном эксперименте, ошибка определения фотофизических параметров не превышает 20%. Это является приемлемым для ряда применений, особенно в тех случаях, когда используются не абсолютные значения параметров, а их изменение под действием тех или иных факторов.
Для реализации описанного алгоритма был разработан лазерный спектрометр на базе излучателя с активными элементами из ИАГ:Nd3+, генерирующий 25-нс импульсы на основной длине волны 1064 нм с преобразованием во вторую гармонику (длина волны 532 нм), энергия в импульсе которой плавно менялась от нуля до максимального значения 12 мДж с помощью ячейки Поккельса.
Для регистрации сигнала флуоресценции использовался фотоэлектронный умножитель (Hamamatsu) с повышенной чувствительностью в красной области спектра. Спектральная селекция осуществлялась узкополосным фильтром с максимумом пропускания на длине волны 685 нм, что соответствует положению максимума полосы флуоресценции Хл а. При использованной в наших экспериментах концентрации водорослей вкладом полосы КР воды (длина волны максимума 651 нм, ширина на полувысоте 20 нм) в регистрируемый сигнал можно было пренебречь.
Нормировка сигнала флуоресценции осуществлялась на сигнал в реперном канале, пропорциональный интенсивности лазерного излучения. В качестве детектора реперного канала использовался PIN-фотодиод со встроенным предусилителем (Hamamatsu). Аналогичный детектор использовали и в системе запуска аналого-цифрового преобразователя (АЦП).
Для оцифровки сигналов с детекторов применены два многофункциональных устройства ввода-вывода данных (National Instruments) c 16-битными АЦП. С учетом шумов и нелинейности детекторов система регистрации обеспечивает эффективный динамический диапазон порядка 5000 единиц, что позволяет регистрировать кривую насыщения флуоресценции микроводорослей в диапазоне изменения плотности потока фотонов возбуждающего излучения F=6·1021–3 . 1025 см-2 . с-1.
Метод индукции
и релаксации
флуоресценции (FIRe)
Метод FIRe [9] основан на регистрации с высоким временным разрешением (масштаб времени от 1 мкс) кривой индукции и последующей релаксации флуоресценции молекул Хл а, возбуждаемой короткими импульсами света длительностью от 0,5 мкс и пиковой мощностью до 1 Вт/см2 (рис.3).
Типичный протокол измерения фотофизических параметров с помощью метода FIRe состоит из четырех этапов. На первом этапе для возбуждения флуоресценции используется одиночный мощный импульс света длительностью порядка 100 мкс, переводящий все реакционные центры (РЦ) фотосинтетического аппарата (РЦ –белковые комплексы, использующие поглощенную солнечную энергию для разделения зарядов [5] ) в закрытое состояние, когда эффективный перенос энергии с молекул Хл а светособирающей антенны на РЦ прекращается. При этом за время импульса интенсивность флуоресценции возрастает от своего минимального значения F0 до максимального значения FM.
На втором этапе длительностью порядка 500 мс регистрируется релаксация флуоресценции, характеризующая постепенное открытие РЦ. Для этого используется специальная последовательность импульсов, при которой их действие на состояние РЦ сведено к минимуму и учитывается при обработке кривых релаксации.
На третьем этапе для возбуждения флуоресценции используется длинный импульс света (длительность порядка 50 мс) с высокой пиковой мощностью, который не только переводит все РЦ в закрытое состояние, но и влияет на ряд других участков цепи миграции зарядов в фотосинтетическом аппарате. На этом участке интенсивность флуоресценции достигает своего максимального значения F′M, отличающегося, вообще говоря, от значения FM.
На четвертом этапе регистрируется релаксация флуоресценции до уровня F′0.
Определенные на описанных этапах значения интенсивности флуоресценции, а также времена, за которые достигаются максимальные значения FM и F′M (скорости индукции), и минимальные значения F0 и F′0 (скорости релаксации), используются для расчета ряда фотофизических параметров, которые характеризуют функциональное состояние фотосинтетического аппарата. К таким параметрам относятся: переменная флуоресценция FV = FM – F0; показатель фотосинтетической активности FV/FM, характеризующий относительное количество изначально открытых (фотосинтетически активных) РЦ, участвующих в разделении зарядов; эффективное сечение фотохимического разделения зарядов σPS2, характеризующее вероятность разделения зарядов в РЦ при попадании на фотосинтетический аппарат одного фотона; скорости релаксации флуоресценции на 2-м этапе τ-1Qa, характеризующие восстановление реакционных центров до открытого состояния (времена переноса электрона между первичным и вторичным акцепторами в цепи транспорта электронов); коэффициент нефотохимического тушения nq, характеризующий эффективность фотопротекторных механизмов (нефотохимического тушения возбужденных состояний пигментов – хлорофилла а в водорослях, аллофикоцианина в цианобактериях [19]).
В качестве источников света в FIRe-флуориметре используются мощные светодиоды с длиной волны излучения 470 нм и 590 нм (ширина полосы излучения по полувысоте – 20 нм), которые попадают в полосы поглощения молекул Хл а и/или других светособирающих пигментов. Сигнал флуоресценции регистрируется лавинным фотодиодом и оцифровывается 12-битным АЦП с частотой порядка 1 МГц. Спектральная селекция сигнала флуоресценции осуществляется узкополосным фильтром с максимум полосы пропускания на длине волны 685 нм. Небольшая часть возбуждающего излучения направляется отводной пластинкой на PIN-фотодиод реперного канала.
Объекты
В рамках апробации подхода, основанного на комплексном применении методов FIRe и НЛФ для наиболее полной диагностики функционального состояния ФСО, были проведены эксперименты по определению набора фотофизических параметров трех классов водных ФСО, выращенных в разных условиях. В качестве тестовых объектов были выбраны чистые культуры следующих ФСО: диатомовой микроводоросли Thalassiosira weissflogii, зооксантелл Symbiodium sp. CCMP 2467 и цианобактерий Synechococcus sp. CCMP 1379. Каждый из выбранных объектов был разделен на несколько групп: контрольную, выращенную при стандартных для данного объекта условиях среды, и группы, выращенные при различных уровнях солености (40, 18 и 5‰*) и азотного питания (норма – 1N; в два раза выше нормы – 2N; в два раза ниже нормы – 0,5N).
РЕЗУЛЬТАТЫ
И ОБСУЖДЕНИЕ
Значения фотофизических параметров выбранных объектов, определенные методом нелинейной лазерной флуориметрии из экспериментальных кривых насыщения, приведены в табл.1. Полученные результаты показывают достаточно высокую чувствительность диатомовых водорослей к изменению солености питательной среды (для этих водорослей близкой к нормальной является соленость 18‰), при этом изменение уровня азотного питания в четыре раза более слабо сказалось на значении фотофизических параметров, за исключением возросшего времени дезактивации возбужденного состояния молекул Хл а τ в случае увеличения азотного питания в два раза относительно стандартной среды. Это может быть связано с уменьшением скорости переноса энергии на реакционный центр (вероятности фотохимического тушения). В работе [20] это связывают с уменьшением доли фотосинтетически активных реакционных центров при увеличении содержания азота в среде.
Отклонение солености от нормального для данной водоросли значения 18‰ (как в сторону увеличения, так и уменьшения) вызывает значительное увеличение как параметра насыщения A, так и времени дезактивации τ. Это говорит о серьезном ингибировании у данных объектов первичных реакций фотосинтеза.
Кроме того, описанные изменения в среде привели к незначительному уменьшению максимальной скорости синглет-синглетной аннигиляции γ . n0, что может быть связано с влиянием их на локальную концентрацию молекул Хл а.
Еще большей чувствительностью к изменениям в окружающей среде обладают зооксантеллы – водоросли, живущие в тканях коралловых полипов. Уменьшение содержания азотного питания в два раза приводит к заметному ингибированию фотосинтетической активности клеток. Вариация солености питательной среды (нормальной для этой водоросли является соленость 40‰) существенно уменьшает значение параметра Ф0, который в первом приближении пропорционален концентрации клеток, тщ есть снижает скорость деления клеток. Это в совокупности с увеличением параметра насыщения A свидетельствует о сильном ингибировании фотосинтеза.
Значения фотофизических параметров выбранных объектов, определенные методом FIRe, приведены в табл.2.
Полученные с помощью метода индукции и релаксации флуоресценции значения фотофизических параметров ФС 2 как целого – эффективного сечения и фотосинтетической активности – для диатомовой водоросли не зависят в пределах погрешности от величины солености и содержания азота в среде. Единственным параметром, чувствительным к изменениям характеристик среды, оказалось время, характеризующее перенос электрона между первичным и вторичным акцептором электронов (и, соответственно, динамику открытия РЦ). Наблюдается увеличение этого параметра для культуры, выращенной в условиях повышенного содержания азота. Это означает появление нарушений в цепи электронного транспорта и согласуется с данными нелинейной флуориметрии, поскольку, несмотря на принципиальное различие параметров τ, определяемого методом нелинейной флуориметрии, и τ0, восстанавливаемого из кривой релаксации флуоресценции, они так или иначе отражают изменение состояния, в котором находятся РЦ, и в общем случае увеличение этих времен говорит о неких нарушениях в работе РЦ. Увеличение параметра τQa имеет место и при изменении солености (относительно нормального для данной водоросли значения 18‰), однако эти изменения не так значительны. Этот результат также согласуется с данными нелинейной флуориметрии.
Подчеркнем еще раз тот факт, что эффективное сечение фотосистемы 2 для всех образцов оставалось постоянным, а в случае нелинейной флуориметрии наблюдались хотя и незначительные, но вполне обнаружимые вариации сечения поглощения молекул Хл а. Сечения, определяемые обоими методами, в первом приближении связаны между собой, поскольку эффективное сечение фотосистемы 2 есть произведение суммарного сечения поглощения всех молекул Хл а фотосистемы 2 на эффективность разделения зарядов в РЦ. Это объясняет тот факт, что данные параметры, определенные для диатомовой водоросли с помощью различных методик, зависят от внешних факторов в целом синхронно, хотя и не полностью идентично.
В случае зооксантелл изменения наблюдали в основном для образца с минимальной соленостью: происходит значительное уменьшение фотосинтетической активности и сечения σPS2, а время электронного транспорта τQa увеличивается. Это свидетельствует о гибели данной культуры вследствие неспособности адаптироваться к среде со столь низкой соленостью. Для других образцов отметим следующие изменения: незначительные уменьшения фотосинтетической активности для образцов, выращенных в условиях пониженной солености (18‰) и при увеличенном содержании азота в среде; уменьшение коэффициента нефотохимического тушения для образца с двойным содержанием азота; незначительное увеличение времен электронного транспорта для культур с пониженным содержанием азота в среде и низкой концентрацией солей.
Для цианобактерий (нормальной для них является соленость 40‰) изменение солености сказалось в первую очередь на изменениях в коэффициенте нефотохимического тушения. Более низкий уровень солености приводит к уменьшению эффективности механизмов нефотохимического тушения, при этом остальные параметры не претерпевают значительных изменений. Можно предположить, что изменение солености в среде приводит к изменению внутриклеточных характеристик (например, вязкости), что изменяет процессы, связанные с диссипацией избыточной энергии.
Изменение минерального питания (как его увеличение, так и его уменьшение) отражается прежде всего на времени электронного транспорта между первичным и вторичным донором электронов τQa – происходит незначительное уменьшение этого параметра.
Сравнительный анализ зависимостей фотофизических параметров, измеренных методами FIRe и НЛФ, позволяет заключить, что эти параметры в целом изменяются синхронно при изменениях солености и концентрации азота, но с разной производной, тем самым дополняя друг друга и увеличивая избирательность при определении влияния того или иного фактора среды.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Показана возможность использования набора фотофизических параметров водных фотосинтезирующих организмов (микроводорослей и цианобактерий) – параметров ФС 2 как целого (определяемых методом индукции и релаксации флуоресценции, FIRe) и Хл а in vivo (определяемых методом нелинейной лазерной флуориметрии, НЛФ) – для диагностики изменения их физиологического состояния при изменении факторов среды (на примере изменений солености и концентрации азота, моделирующих вариацию этих факторов в акваториях Мирового океана как следствие глобального изменения климата). Обнаружено синхронное, в целом, поведение этих групп параметров, однако в характере их изменения имеются различия, увеличивающие диагностические возможности комплексного метода, использующего полный набор параметров, по сравнению с раздельным применением каждого из указанных методов флуориметрии ФСО.
Установлены различия в степени влияния указанных факторов среды на физиологическое состояние разных групп водных ФСО (диатомовых водорослей, зооксантелл и цианобактерий), отражаемое фотофизическими параметрами.
Наиболее устойчивыми к изменениям среды оказались цианобактерии, а наиболее чувствительными – зооксантеллы. Это заставляет предположить, что одним из результатов влияния глобального изменения климата на водные экосистемы будет трансформация видовой структуры фитопланктонного сообщества в сторону возрастания роли цианобактерий (отметим, что отдельные виды цианобактерий токсичны). Еще один тревожный прогноз – негативное влияние глобального изменения климата на физиологическое состояние кораллов, в симбиозе с которыми находятся зооксантеллы. Это наводит на мысль, что причинами отмечаемого повсеместно ухудшения состояния коралловых рифов являются не только антропогенные факторы, но и климатические, и означает, что флуоресцентный мониторинг коралловых рифов с определением фотофизических характеристик зооксантелл может быть одним из наиболее эффективных средств обнаружения влияния глобального изменения климата на морскую биоту на его ранних стадиях.
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ и CRDF (№ 09–05–92515–ИК и № RUG1–2952–MO–09). Авторы благодарят Е.Н. Воронову (Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова) за подготовку препаратов водорослей и цианобактерий, выращенных при разных значениях солености и концентрации азота.
Литература
1. Wood J., Tett P., Edwards A. – Journal of Ecology, 1973, 61, 569.
2. Flore C., Jarett J., Olson N., Lesser M. – Trends in Microbiology, 2010,18, 455.
3. Hoge F., Swift R. – Applied Optics, 1983,22, 2271.
4. Фадеев В., Бунин Д., Венедиктов П. – Квантовая электроника, 1996, 23, 963.
5. Говинджи Д., Уитмарш Дж. Фотосинтез. – М: Мир, 1987.
6. Laisk A., Oja V., Rasulov B. et al. – Plant Physiology, 1997,115, 803 .
7. Maxwell K., Johnson G. – Journal of Experimental Botany, 2000, 51, 659.
8. Joshi M., Mohanty P. – Journal of Scientific and Industrial Research, 1995, 54, 155.
9. Gorbunov M., Falkowski P. In Proceedings of XIII International Congress of Photosynthesis (Montreal: Allen Press, 2004, p. 1029).
10. Фадеев В. Вестник Московского университета. Серия 3. Физика. Астрономия, 1998, 4, 49.
11. Гостев Т., Фадеев В. – Квантовая электроника, 2011 (в печати).
12. Fork D., Mohanty P. In Light Emission by Plants and Bacteria. –London: Academic Press, 1986, p. 451.
13. Фадеев В. В. Физические проблемы экологии (экологическая физика). – М: Изд–во физфак МГУ, 1999.
14. Маслов Д., Фадеев В., Литвинов П. Вестник Московского университета Сер. 3. Физика. Астрономия, 2002, 1, 34.
15. Клышко Д., Фадеев В. – Доклады АН СССР, 1978, с.238,
320.
16. Маслов Д., Остроумов Е., Фадеев В. – Квантовая электроника, 2006, 36, 163.
17. Paschenko V., Kononenko A., Protasov S. et al. – Biochimica Et Biophysica Acta, 1977, 461, 403.
18. Маслов Д., Ильяш Л., Остроумов Е., Погосян С. и др. – Биофизика, 2005, 50, 843.
19. Vredenberg W., Durchan M., Prasil O. – Biochimica Et Biophysica Acta, 2009,1787, 1468.
20. Shangguan Z., Shao M., Dyckmans J. – Journal of Plant Physiology, 2000,156, 46.
Отзывы читателей
