eng
TS_pub
technospheramag
technospheramag
ТЕХНОСФЕРА_РИЦ
Выпуск #2/2024
М. Е. Степанов, У. А. Хохрякова, Т. В. Егорова, К. А. Магарян, А. В. Наумов
Проливая свет на ДНК-оригами: практика использования
Проливая свет на ДНК-оригами: практика использования
Просмотры: 728
DOI: 10.22184/1993-7296.FRos.2024.18.2.166.174
В современной фотонике существует запрос на технологии воспроизводимого и контролируемого получения наноструктур, поскольку многие интересные и важные оптические процессы разыгрываются на характерном для таких структур субдифракционном масштабе. Однако для работы со светом на нанометровых расстояниях требуется нанометровая точность в позиционировании объектов, добиться которой стандартными методами оказывается подчас крайне непросто. Одним из новых подходов, способных стать ответом на этот вызов, является использование ДНК-оригами: строение полимерной молекулы ДНК позволяет, с одной стороны, химически «настраивать» ее геометрию для придания ей произвольной формы на естественном для нее нанометровом масштабе, а с другой, – адресно размещать нанообъекты в любой позиции вдоль ее цепи. В настоящем обзоре рассмотрены некоторые практические аспекты получения ДНК-оригами.
В современной фотонике существует запрос на технологии воспроизводимого и контролируемого получения наноструктур, поскольку многие интересные и важные оптические процессы разыгрываются на характерном для таких структур субдифракционном масштабе. Однако для работы со светом на нанометровых расстояниях требуется нанометровая точность в позиционировании объектов, добиться которой стандартными методами оказывается подчас крайне непросто. Одним из новых подходов, способных стать ответом на этот вызов, является использование ДНК-оригами: строение полимерной молекулы ДНК позволяет, с одной стороны, химически «настраивать» ее геометрию для придания ей произвольной формы на естественном для нее нанометровом масштабе, а с другой, – адресно размещать нанообъекты в любой позиции вдоль ее цепи. В настоящем обзоре рассмотрены некоторые практические аспекты получения ДНК-оригами.
Проливая свет на ДНК-оригами: практика использования
М. Е. Степанов 1, У. А. Хохрякова 1, Т. В. Егорова 1, К. А. Магарян 1, А. В. Наумов 1, 2
Московский педагогический государственный университет (МПГУ), Москва, Россия
Физический институт им. П. Н. Лебедва РАН, Троицкое обособленное подразделение (ТОП ФИАН), Москва, Троицк, Россия
В современной фотонике существует запрос на технологии воспроизводимого и контролируемого получения наноструктур, поскольку многие интересные и важные оптические процессы разыгрываются на характерном для таких структур субдифракционном масштабе. Однако для работы со светом на нанометровых расстояниях требуется нанометровая точность в позиционировании объектов, добиться которой стандартными методами оказывается подчас крайне непросто. Одним из новых подходов, способных стать ответом на этот вызов, является использование ДНК-оригами: строение полимерной молекулы ДНК позволяет, с одной стороны, химически «настраивать» ее геометрию для придания ей произвольной формы на естественном для нее нанометровом масштабе, а с другой, – адресно размещать нанообъекты в любой позиции вдоль ее цепи. В настоящем обзоре рассмотрены некоторые практические аспекты получения ДНК-оригами.
Ключевые слова: ДНК-нанотехнологии, ДНК-оригами, численное моделирование, наноструктуры
Статья получена: 12.12.2023
Статья принята: 19.01.2024
Введение
Оригами – древнее японское искусство складывать бумагу без разрезов, придавая ей произвольную форму (слово origami буквально означает «складывать» (ori, 折り) «бумагу» (gami, 紙)). Вдохновившись этим искусством, научное сообщество постепенно пришло к идее создания наноструктур путем последовательного сворачивания (самосборки) длинной молекулы ДНК (т. н. скаффолда) с помощью коротких фрагментов ДНК, играющих роль скрепок. Оказалось, что процесс самосборки можно химически «запрограммировать» заранее, благодаря особенностям строения молекулы ДНК [1] (см. молекулярные основы метода ДНК-оригами в первой части нашего обзора «Проливая свет на ДНК-оригами» [2]), чтобы придать молекуле произвольную форму.
Однако элегантность этой идеи в реальности сталкивается с определенными практическими сложностями, затрудняющими ее использование. В данной статье рассматриваются некоторые аспекты возникающих на этом пути проблем: вопрос рационального подбора молекул-скрепок, направляющих самосборку молекулы ДНК, особенности процедуры самосборки и характеризации полученных ДНК-оригами наноструктур.
Существует большое количество других интересных методов создания наноструктур [3–23], однако ДНК-оригами выделяется среди них степенью контроля и точности результата. Используя этот метод, можно воспроизводимо создавать молекулярные наноконструкции на основе ДНК с возможностью адресного обращения практически к любому звену (нуклеотиду) в структуре ее молекулярной цепи для размещения нанообъектов в заранее выбранной позиции, что делает метод ДНК-оригами уникальным инструментом по управляемому созданию нанокомплексов [24].
1. Моделирование ДНК-оригами
Принцип построения ДНК-оригами заключается в придании длинной кольцевой одноцепочечной молекуле ДНК (скаффолду) нужной геометрии путем скрепления ее фрагментов молекулярными скрепками – олигонуклеотидами (короткими фрагментами ДНК), – комплементарно связывающими нужные участки скаффолда [2]. Проблема заключается в том, что даже простая ДНК-оригами конструкция может включать сотни типов таких молекулярных скрепок индивидуального состава. Ошибки в их выборе могут привести к резкому ухудшению качества самосборки ДНК-оригами, что делает их рациональный подбор крайне важной задачей. Ответом на этот вызов стало развитие специализированного программного обеспечения, позволяющего упростить и автоматизировать процесс выбора конкретного набора скрепок, которые могут обеспечивать сворачивание выбранного скаффолда в определенную геометрическую форму (ДНК-оригами).
Учитывая недавнее появление области ДНК-нанотехнологий, практика использования CAD (Computer Aided Design) для его проектирования сложилась еще не до конца, и поэтому реальный процесс проектирования может быть крайне неинтуитивным. В работе [1] было предложено подразделить все среды проектирования ДНК-оригами на три поколения согласно возможностям их функционала.
К первому поколению можно отнести программу CaDNAno, позволяющую создавать индивидуальные наноструктуры ДНК для широкого спектра применений. Программа обладает удобным интерфейсом, с помощью которого пользователи могут проектировать ДНК-модели, рисуя их в 2D (рис. 1a). Из-за отсутствия 3D-интерфейса возникает сложность в проектировании трехмерных структур, однако Cadnano поддерживает экспорт моделей в различные форматы файлов для более сложного моделирования.
Программы второго поколения рассматриваются как более удобные в использовании и менее требовательные к объему технических деталей самосборки. В качестве представителя рассмотрим программу TALOS (Three-dimensional Algorithmically-generated Library of DNA Origami Shapes). Программа автоматически подбирает молекулярные скрепки для получения 3D-ДНК-оригами одной из 20 геометрических форм-каркасов (рис. 1b).
Программное обеспечение третьего поколения расширяет доступный функционал: появляется возможность тонкого редактирования структуры ДНК, визуализации готовой модели и ее параметров, моделирования внутренних взаимодействий. Примером ПО третьего поколения (рис. 1c) можно считать Adentia Samson (2021).
Нужно отметить, что подходы к решению задачи о самосборке и предсказанию геометрии ДНК-оригами наноструктур имеют большой потенциал для оптимизации и постоянно совершенствуются [25].
2. Сборка и очистка ДНК-оригами
На этапе сборки ДНК-оригами (рис. 2) требуется высокая чистота компонентов и точность подбора условий процедуры. После того, как оптимальный дизайн скрепок осуществлен с помощью моделирования, их синтез заказывается в специализированных фирмах (в России Синтол, Евроген, ДНК-синтез и т. д.).
Выбор скаффолда для получения ДНК-оригами определяется размером и сложностью желаемой структуры ДНК-оригами. Чаще всего в качестве скаффолда используется одноцепочечная кольцевая молекула ДНК-генома бактериофага М13 длиной 7 249 нуклеотидов. Очевидно, что размер структуры ДНК-оригами ограничен длиной скаффолда, используемого для сборки структуры. Эту проблему можно обойти, если использовать более длинные одноцепочечные молекулы ДНК в качестве скаффолдов, либо применять дополнительные скрепки, комплементарные частично другим выступающим скрепкам, а частично – скаффолду, что позволяет формировать дополнительные элементы, выступающие за пределы основной структуры ДНК-оригами и увеличивать ее размер.
Стабильность спаривания оснований в молекуле ДНК очень сильно зависит от наличия в среде катионов [2]. В большинстве протоколов для сборки ДНК-оригами реакция происходит при pH = 8 в трис-ацетатном буфере (ТАЕ) c концентрацией ионов Mg2+ от 5 до 20 mM. К буферному раствору с нужной концентрацией ионов Mg2+ добавляют ДНК-скаффолд и скрепки в соотношении 1 : 10 или 1 : 20 (чтобы уменьшить количество образующихся неспецифических агрегатов), и подвергают специфической процедуре термической обработки (отжигу). При процедуре отжига смесь сначала нагревают на короткое время почти до температуры кипения, а потом медленно охлаждают, в результате чего происходит спонтанная самосборка структуры ДНК-оригами. Длительность процесса охлаждения зависит от сложности структуры ДНК-оригами и занимает время от нескольких часов для маленьких 2D-конструкций до недели для многослойных 3D-конструкций. Создание сложных иерархических структур ДНК-оригами (супер-оригами) требует сборки в несколько этапов.
Следующий этап – очистка и концентрирование полученной структуры ДНК-оригами – имеет критическое значение для оптического/биомедицинского применения. С помощью электрофореза в агарозном геле оценивается качество и чистота сборки конструкции ДНК-оригами, поскольку электрофоретическая подвижность «правильных» и «побочных» продуктов сборки различается. Очистку ДНК-оригами обычно проводят с помощью электрофореза в агарозном геле с последующей экстракцией «правильного» продукта из кусочка вырезанного геля, ультрафильтрацией, преципитацией с полиэтиленгликолем (ПЭГ), ультрацентрифугированием или гель-фильтрацией (эксклюзионной хроматографией). Выбор метода очистки зависит от конечной цели применения структуры ДНК-оригами.
3. Методы характеризации ДНК-оригами
Методы исследования ДНК-оригами структур можно условно разделить на две группы: ансамблевые методы и методы исследования на уровне одиночных молекул. Первые (гель-электрофорез, флуоресцентная спектроскопия, спектроскопия кругового дихроизма) позволяют составить общую картину, усредненную по большому числу собранных структур: получилось ли в результате собрать ДНК-оригами конструкцию и с каким количеством побочных продуктов. Вторые (электронная и атомно-силовая микроскопия) позволяют регистрировать отдельные молекулы [26, 27]. В сочетании с миллисекундным временным разрешением современные атомно-силовые микроскопы способны регистрировать быстрые динамические процессы в одиночных ДНК-оригами, а применение модифицированных игл зондов позволяет исследовать эластичность ДНК-оригами [28]. Электронная микроскопия высокого разрешения способна зарегистрировать отдельные частицы, прикрепленные на противоположных сторонах одного нуклеотида ДНК, расстояние между которыми всего 0,34 нм [29]. Такое высокое разрешение позволяет отслеживать топологические изменения в одиночных структурах, однако приводит к скорому разрушению ДНК-структуры из-за необходимости готовить образец в вакууме. Для преодоления данной трудности применяются методы криогенной электронной микроскопии [30].
Каждая из представленных техник обладает своими преимуществами и ограничениями. Комбинирование различных методов может обеспечить более полное понимание структуры и свойств ДНК-оригами.
Заключение
Метод ДНК-оригами позволяет контролируемо придавать форму молекуле ДНК на естественном для этой молекулы масштабе (нанометровом) точно также, как японское искусство оригами позволяет придать форму листу бумаги на масштабе сантиметров. Отличие заключается в том, что для манипуляции молекулами организуются специальные химические и физические условия, в которых структура ДНК-оригами собирает сама себя. Разумеется, такой процесс требует кропотливой подготовки, но его результаты (в том числе в области фотоники) способны окупить все усилия, поскольку они открывают возможность контролировать как форму молекул ДНК, так и расположение нанообъектов с нанометровой точностью в любой позиции вдоль этой формы. При этом метод ДНК-оригами достаточно молод и его возможности еще далеко не исчерпаны.
Благодарности
Работа выполнена в рамках темы государственного задания Московского педагогического государственного университета (МПГУ) «Физика наноструктурированных материалов и высокочувствительная сенсорика: синтез, фундаментальные исследования и приложения в фотонике, науках о жизни, квантовых и нанотехнологиях» при поддержке Министерства просвещения РФ.
REFERENCES
S. Dey, C. Fan, K. V. Gothelf, J. Li, C. Lin, L. Liu, N. Liu, M. A. D. Nijenhuis, B. Saccà, F. C. Simmel, H. Yan, P. Zhan. DNA origami. Nature Reviews Methods Primers. 2021;1.
M. E. Stepanov, U. A. Khokhryakova, T. V. Egorova, K. A. Magaryan, A. V. Naumov. Shedding light on DNA origami. PHOTONICS Russia. 2024; 18 (1): 72–80. DOI: 10.22184/1993‑7296.FRos.2022.16.8.600.602.
P. A. Demina, K. V. Khaydukov, V. V. Rocheva, R. A. Akasov, A. N. Generalova, E. V. Khaydukov. Technology of Infrared Photopolymerization. PHOTONICS Russia. 2022; 16(8): 600–602. DOI: 10.22184/1993‑7296.FRos.2024.18.1.72.80.
N. Anscombe. Direct laser writing. Nature Photonics. 2010;4;22–23.
P. Apel. Track etching technique in membrane technology. Radiation Measurements. 34 (2001) 559–566.
A. Balachandran, S. P. Sreenilayam, K. Madanan, S. Thomas, D. Brabazon. Nanoparticle production via laser ablation synthesis in solution method and printed electronic application – A brief review. Results in Engineering. 2022;16.
V. I. Balykin, P. A. Borisov, V. S. Letokhov, P. N. Melentiev, S. N. Rudnev, A. P. Cherkun, A. P. Akimenko, P. Y. Apel, V. A. Skuratov. Atom “pinhole camera” with nanometer resolution. JETP Letters. 2006;84; 466–469.
Y. E. Begantsova, R. Zvagelsky, E. V. Baranov, D. A. Chubich, Y. V. Chechet, D. A. Kolymagin, A. V. Pisarenko, A. G. Vitukhnovsky, S. A. Chesnokov. Imidazole-containing photoinitiators for fabrication of sub-micron structures by 3D two-photon polymerization. European Polymer Journal. 2021;145.
D. A. Chubich, D. A. Kolymagin, I. A. Kazakov, A. G. Vitukhnovsky. Morphology and Structural Parameters of Three-Dimensional Structures Created Using STED Nanolithography. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2018;82;1012–1017.
J. Fan, L. Qian. Quantum dot patterning by direct photolithography. Nat Nanotechnol. 2022;17: 906–907.
J. F. Galisteo-Lopez, M. Ibisate, R. Sapienza, L. S. Froufe-Perez, A. Blanco, C. Lopez. Self-assembled photonic structures. Adv Mater. 2011;23; 30–69.
G. N. Gol’tsman, O. Okunev, G. Chulkova, A. Lipatov, A. Semenov, K. Smirnov, B. Voronov, A. Dzardanov, C. Williams, R. Sobolewski. Picosecond superconducting single-photon optical detector. Applied Physics Letters. 2001;79; 705–707.
E. Gordon, A. Karabulin, V. Matyushenko, V. Sizov, I. Khodos. Stability and structure of nanowires grown from silver, copper and their alloys by laser ablation into superfluid helium. Phys Chem Chem Phys. 2014;16;25229–25233.
M. Grzelczak, J. Vermant, E. M. Furst, L. M. Liz-Marzan. Directed self-assembly of nanoparticles. ACS Nano. 2010;4:3591–3605.
D. Huo, M. J. Kim, Z. Lyu, Y. Shi, B. J. Wiley, Y. Xia. One-Dimensional Metal Nanostructures: From Colloidal Syntheses to Applications. Chem Rev. 2019;119;8972–9073.
A. Kaur, B. Bajaj, A. Kaushik, A. Saini, D. Sud. A review on template assisted synthesis of multi-functional metal oxide nanostructures: Status and prospects. Materials Science and Engineering: B. 2022;286.
E. P. Kozhina, S. N. Andreev, V. P. Tarakanov, S. A. Bedin, I. M. Doludenko, A. V. Naumov. Study of Local Fields of Dendrite Nanostructures in Hot Spots Formed on SERS-Active Substrates Produced via Template-Assisted Synthesis. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2021;84:1465–1468.
K. A. Magaryan, M. A. Mikhailov, K. R. Karimullin, I. A. Vasilieva, G. V. Klimusheva. Temperature dependence of the luminescence spectra of liquid crystal composites with CdSe quantum dots. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2014;78: 1336–1340.
O. M. Marago, P. H. Jones, P. G. Gucciardi, G. Volpe, A. C. Ferrari. Optical trapping and manipulation of nanostructures. Nat Nanotechnol. 2013;8; 807–819.
F. Porrati, S. Barth, G. C. Gazzadi, S. Frabboni, O. M. Volkov, D. Makarov, M. Huth. Site-Selective Chemical Vapor Deposition on Direct-Write 3D Nanoarchitectures. ACS Nano. 2023;17: 4704–4715.
C. Tan, J. Chen, X.-J. Wu, H. Zhang. Epitaxial growth of hybrid nanostructures. Nature Reviews Materials. 2018;3.
X. Wang, X. Dai, H. Wang, J. Wang, Q. Chen, F. Chen, Q. Yi, R. Tang, L. Gao, L. Ma, C. Wang, X. Wang, G. He, Y. Fei, Y. Guan, B. Zhang, Y. Dai, X. Tu, L. Zhang, L. Zhang, G. Zou. All-Water Etching-Free Electron Beam Lithography for On-Chip Nanomaterials. ACS Nano. 2023;17; 4933–4941.
R. Zvagelsky, D. Chubich, D. Kolymagin, A. Pisarenko, A. Vitukhnovsky. Fabrication of templates for metallic nanoantennas by STED-DLW lithography. 2019.
I. V. Semchenko, S. A. Khakhomov. Application of DNA molecules in nature- inspired technologies: a mini review. Frontiers in Nanotechnology. 2023;5.
R. V. Reshetnikov, A. V. Stolyarova, A. O. Zalevsky, D. Y. Panteleev, G. V. Pavlova, D. V. Klinov, A. V. Golovin, A. D. Protopopova. A coarse-grained model for DNA origami. Nucleic Acids Res. 2018;46; 1102–1112.
S. Ramakrishnan, B. Shen, M. A. Kostiainen, G. Grundmeier, A. Keller, V. Linko. Real-Time Observation of Superstructure-Dependent DNA Origami Digestion by DNase I Using High-Speed Atomic Force Microscopy. Chembiochem. 2019;20;2818–2823.
S. M. Douglas, H. Dietz, T. Liedl, B. Hogberg, F. Graf, W. M. Shih. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 2009;459; 414–418.
A. Rajendran, M. Endo, H. Sugiyama. Single-molecule analysis using DNA origami. Angew Chem Int Ed Engl. 2012;51; 874–890.
N. Li, Y. Shang, R. Xu, Q. Jiang, J. Liu, L. Wang, Z. Cheng, B. Ding. Precise Organization of Metal and Metal Oxide Nanoclusters into Arbitrary Patterns on DNA Origami. J Am Chem Soc. 2019;141: 17968–17972.
X. C. Bai, T. G. Martin, S. H. Scheres, H. Dietz. Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:20012–20017.
АВТОРЫ
Максим Евгеньевич Степанов – м. н. с., Московский педагогический государственный университет (МПГУ), каф. теор. физики им. Э. В. Шпольского, м. н. с. лаб. физики перспективных материалов и наноструктур, Москва, Россия.
РИНЦ ID: 334465
Scopus ID: 57195265809
ResearcherID: AAB‑6181-2022
ORCID: 0000-0002-0332-1235
Хохрякова Ульяна Александровна – бакалавр по направлению «Фундаментальная физика» МПГУ, лаборант-исследователь молодежной лаборатории биофотоники и наноинженерии.
Егорова Татьяна Владимировна – к. б. н., зав. молодежной лаб. биофотоники и наноинженерии, МПГУ, Москва, Россия.
Scopus ID: 56868341400
ORCID: 0000-0002-7554-5246
ResearcherID: P‑9982-2017
Магарян Константин Арутюнович – к. ф.‑ м. н., МПГУ, каф. теор. физики им. Э. В. Шпольского, с. н. с. лаб. физики перспективных материалов и наноструктур.
РИНЦ ID: 723988
ResearcherID: A‑4208-2014
ORCID: 0000-0003-4754-4657
Наумов Андрей Витальевич – член-корр. РАН, д.ф-м.н., Рук. Троицкого филиала ФИАН им. П. Н. Лебедева, зав. каф., МПГУ, член-корр. РАН, доц., Москва, Россия.
РИНЦ ID: 35867
Scopus ID: 7201349036,
ResearcherID: E‑8905-2010
ORCID: 0000-0001-7938-9802
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов. Все авторы приняли участие в написании статьи и дополнили рукопись в части своей работы.
ВКЛАД ЧЛЕНОВ
АВТОРСКОГО КОЛЛЕКТИВА
Статья подготовлена на основе работы всех членов авторского коллектива.
М. Е. Степанов 1, У. А. Хохрякова 1, Т. В. Егорова 1, К. А. Магарян 1, А. В. Наумов 1, 2
Московский педагогический государственный университет (МПГУ), Москва, Россия
Физический институт им. П. Н. Лебедва РАН, Троицкое обособленное подразделение (ТОП ФИАН), Москва, Троицк, Россия
В современной фотонике существует запрос на технологии воспроизводимого и контролируемого получения наноструктур, поскольку многие интересные и важные оптические процессы разыгрываются на характерном для таких структур субдифракционном масштабе. Однако для работы со светом на нанометровых расстояниях требуется нанометровая точность в позиционировании объектов, добиться которой стандартными методами оказывается подчас крайне непросто. Одним из новых подходов, способных стать ответом на этот вызов, является использование ДНК-оригами: строение полимерной молекулы ДНК позволяет, с одной стороны, химически «настраивать» ее геометрию для придания ей произвольной формы на естественном для нее нанометровом масштабе, а с другой, – адресно размещать нанообъекты в любой позиции вдоль ее цепи. В настоящем обзоре рассмотрены некоторые практические аспекты получения ДНК-оригами.
Ключевые слова: ДНК-нанотехнологии, ДНК-оригами, численное моделирование, наноструктуры
Статья получена: 12.12.2023
Статья принята: 19.01.2024
Введение
Оригами – древнее японское искусство складывать бумагу без разрезов, придавая ей произвольную форму (слово origami буквально означает «складывать» (ori, 折り) «бумагу» (gami, 紙)). Вдохновившись этим искусством, научное сообщество постепенно пришло к идее создания наноструктур путем последовательного сворачивания (самосборки) длинной молекулы ДНК (т. н. скаффолда) с помощью коротких фрагментов ДНК, играющих роль скрепок. Оказалось, что процесс самосборки можно химически «запрограммировать» заранее, благодаря особенностям строения молекулы ДНК [1] (см. молекулярные основы метода ДНК-оригами в первой части нашего обзора «Проливая свет на ДНК-оригами» [2]), чтобы придать молекуле произвольную форму.
Однако элегантность этой идеи в реальности сталкивается с определенными практическими сложностями, затрудняющими ее использование. В данной статье рассматриваются некоторые аспекты возникающих на этом пути проблем: вопрос рационального подбора молекул-скрепок, направляющих самосборку молекулы ДНК, особенности процедуры самосборки и характеризации полученных ДНК-оригами наноструктур.
Существует большое количество других интересных методов создания наноструктур [3–23], однако ДНК-оригами выделяется среди них степенью контроля и точности результата. Используя этот метод, можно воспроизводимо создавать молекулярные наноконструкции на основе ДНК с возможностью адресного обращения практически к любому звену (нуклеотиду) в структуре ее молекулярной цепи для размещения нанообъектов в заранее выбранной позиции, что делает метод ДНК-оригами уникальным инструментом по управляемому созданию нанокомплексов [24].
1. Моделирование ДНК-оригами
Принцип построения ДНК-оригами заключается в придании длинной кольцевой одноцепочечной молекуле ДНК (скаффолду) нужной геометрии путем скрепления ее фрагментов молекулярными скрепками – олигонуклеотидами (короткими фрагментами ДНК), – комплементарно связывающими нужные участки скаффолда [2]. Проблема заключается в том, что даже простая ДНК-оригами конструкция может включать сотни типов таких молекулярных скрепок индивидуального состава. Ошибки в их выборе могут привести к резкому ухудшению качества самосборки ДНК-оригами, что делает их рациональный подбор крайне важной задачей. Ответом на этот вызов стало развитие специализированного программного обеспечения, позволяющего упростить и автоматизировать процесс выбора конкретного набора скрепок, которые могут обеспечивать сворачивание выбранного скаффолда в определенную геометрическую форму (ДНК-оригами).
Учитывая недавнее появление области ДНК-нанотехнологий, практика использования CAD (Computer Aided Design) для его проектирования сложилась еще не до конца, и поэтому реальный процесс проектирования может быть крайне неинтуитивным. В работе [1] было предложено подразделить все среды проектирования ДНК-оригами на три поколения согласно возможностям их функционала.
К первому поколению можно отнести программу CaDNAno, позволяющую создавать индивидуальные наноструктуры ДНК для широкого спектра применений. Программа обладает удобным интерфейсом, с помощью которого пользователи могут проектировать ДНК-модели, рисуя их в 2D (рис. 1a). Из-за отсутствия 3D-интерфейса возникает сложность в проектировании трехмерных структур, однако Cadnano поддерживает экспорт моделей в различные форматы файлов для более сложного моделирования.
Программы второго поколения рассматриваются как более удобные в использовании и менее требовательные к объему технических деталей самосборки. В качестве представителя рассмотрим программу TALOS (Three-dimensional Algorithmically-generated Library of DNA Origami Shapes). Программа автоматически подбирает молекулярные скрепки для получения 3D-ДНК-оригами одной из 20 геометрических форм-каркасов (рис. 1b).
Программное обеспечение третьего поколения расширяет доступный функционал: появляется возможность тонкого редактирования структуры ДНК, визуализации готовой модели и ее параметров, моделирования внутренних взаимодействий. Примером ПО третьего поколения (рис. 1c) можно считать Adentia Samson (2021).
Нужно отметить, что подходы к решению задачи о самосборке и предсказанию геометрии ДНК-оригами наноструктур имеют большой потенциал для оптимизации и постоянно совершенствуются [25].
2. Сборка и очистка ДНК-оригами
На этапе сборки ДНК-оригами (рис. 2) требуется высокая чистота компонентов и точность подбора условий процедуры. После того, как оптимальный дизайн скрепок осуществлен с помощью моделирования, их синтез заказывается в специализированных фирмах (в России Синтол, Евроген, ДНК-синтез и т. д.).
Выбор скаффолда для получения ДНК-оригами определяется размером и сложностью желаемой структуры ДНК-оригами. Чаще всего в качестве скаффолда используется одноцепочечная кольцевая молекула ДНК-генома бактериофага М13 длиной 7 249 нуклеотидов. Очевидно, что размер структуры ДНК-оригами ограничен длиной скаффолда, используемого для сборки структуры. Эту проблему можно обойти, если использовать более длинные одноцепочечные молекулы ДНК в качестве скаффолдов, либо применять дополнительные скрепки, комплементарные частично другим выступающим скрепкам, а частично – скаффолду, что позволяет формировать дополнительные элементы, выступающие за пределы основной структуры ДНК-оригами и увеличивать ее размер.
Стабильность спаривания оснований в молекуле ДНК очень сильно зависит от наличия в среде катионов [2]. В большинстве протоколов для сборки ДНК-оригами реакция происходит при pH = 8 в трис-ацетатном буфере (ТАЕ) c концентрацией ионов Mg2+ от 5 до 20 mM. К буферному раствору с нужной концентрацией ионов Mg2+ добавляют ДНК-скаффолд и скрепки в соотношении 1 : 10 или 1 : 20 (чтобы уменьшить количество образующихся неспецифических агрегатов), и подвергают специфической процедуре термической обработки (отжигу). При процедуре отжига смесь сначала нагревают на короткое время почти до температуры кипения, а потом медленно охлаждают, в результате чего происходит спонтанная самосборка структуры ДНК-оригами. Длительность процесса охлаждения зависит от сложности структуры ДНК-оригами и занимает время от нескольких часов для маленьких 2D-конструкций до недели для многослойных 3D-конструкций. Создание сложных иерархических структур ДНК-оригами (супер-оригами) требует сборки в несколько этапов.
Следующий этап – очистка и концентрирование полученной структуры ДНК-оригами – имеет критическое значение для оптического/биомедицинского применения. С помощью электрофореза в агарозном геле оценивается качество и чистота сборки конструкции ДНК-оригами, поскольку электрофоретическая подвижность «правильных» и «побочных» продуктов сборки различается. Очистку ДНК-оригами обычно проводят с помощью электрофореза в агарозном геле с последующей экстракцией «правильного» продукта из кусочка вырезанного геля, ультрафильтрацией, преципитацией с полиэтиленгликолем (ПЭГ), ультрацентрифугированием или гель-фильтрацией (эксклюзионной хроматографией). Выбор метода очистки зависит от конечной цели применения структуры ДНК-оригами.
3. Методы характеризации ДНК-оригами
Методы исследования ДНК-оригами структур можно условно разделить на две группы: ансамблевые методы и методы исследования на уровне одиночных молекул. Первые (гель-электрофорез, флуоресцентная спектроскопия, спектроскопия кругового дихроизма) позволяют составить общую картину, усредненную по большому числу собранных структур: получилось ли в результате собрать ДНК-оригами конструкцию и с каким количеством побочных продуктов. Вторые (электронная и атомно-силовая микроскопия) позволяют регистрировать отдельные молекулы [26, 27]. В сочетании с миллисекундным временным разрешением современные атомно-силовые микроскопы способны регистрировать быстрые динамические процессы в одиночных ДНК-оригами, а применение модифицированных игл зондов позволяет исследовать эластичность ДНК-оригами [28]. Электронная микроскопия высокого разрешения способна зарегистрировать отдельные частицы, прикрепленные на противоположных сторонах одного нуклеотида ДНК, расстояние между которыми всего 0,34 нм [29]. Такое высокое разрешение позволяет отслеживать топологические изменения в одиночных структурах, однако приводит к скорому разрушению ДНК-структуры из-за необходимости готовить образец в вакууме. Для преодоления данной трудности применяются методы криогенной электронной микроскопии [30].
Каждая из представленных техник обладает своими преимуществами и ограничениями. Комбинирование различных методов может обеспечить более полное понимание структуры и свойств ДНК-оригами.
Заключение
Метод ДНК-оригами позволяет контролируемо придавать форму молекуле ДНК на естественном для этой молекулы масштабе (нанометровом) точно также, как японское искусство оригами позволяет придать форму листу бумаги на масштабе сантиметров. Отличие заключается в том, что для манипуляции молекулами организуются специальные химические и физические условия, в которых структура ДНК-оригами собирает сама себя. Разумеется, такой процесс требует кропотливой подготовки, но его результаты (в том числе в области фотоники) способны окупить все усилия, поскольку они открывают возможность контролировать как форму молекул ДНК, так и расположение нанообъектов с нанометровой точностью в любой позиции вдоль этой формы. При этом метод ДНК-оригами достаточно молод и его возможности еще далеко не исчерпаны.
Благодарности
Работа выполнена в рамках темы государственного задания Московского педагогического государственного университета (МПГУ) «Физика наноструктурированных материалов и высокочувствительная сенсорика: синтез, фундаментальные исследования и приложения в фотонике, науках о жизни, квантовых и нанотехнологиях» при поддержке Министерства просвещения РФ.
REFERENCES
S. Dey, C. Fan, K. V. Gothelf, J. Li, C. Lin, L. Liu, N. Liu, M. A. D. Nijenhuis, B. Saccà, F. C. Simmel, H. Yan, P. Zhan. DNA origami. Nature Reviews Methods Primers. 2021;1.
M. E. Stepanov, U. A. Khokhryakova, T. V. Egorova, K. A. Magaryan, A. V. Naumov. Shedding light on DNA origami. PHOTONICS Russia. 2024; 18 (1): 72–80. DOI: 10.22184/1993‑7296.FRos.2022.16.8.600.602.
P. A. Demina, K. V. Khaydukov, V. V. Rocheva, R. A. Akasov, A. N. Generalova, E. V. Khaydukov. Technology of Infrared Photopolymerization. PHOTONICS Russia. 2022; 16(8): 600–602. DOI: 10.22184/1993‑7296.FRos.2024.18.1.72.80.
N. Anscombe. Direct laser writing. Nature Photonics. 2010;4;22–23.
P. Apel. Track etching technique in membrane technology. Radiation Measurements. 34 (2001) 559–566.
A. Balachandran, S. P. Sreenilayam, K. Madanan, S. Thomas, D. Brabazon. Nanoparticle production via laser ablation synthesis in solution method and printed electronic application – A brief review. Results in Engineering. 2022;16.
V. I. Balykin, P. A. Borisov, V. S. Letokhov, P. N. Melentiev, S. N. Rudnev, A. P. Cherkun, A. P. Akimenko, P. Y. Apel, V. A. Skuratov. Atom “pinhole camera” with nanometer resolution. JETP Letters. 2006;84; 466–469.
Y. E. Begantsova, R. Zvagelsky, E. V. Baranov, D. A. Chubich, Y. V. Chechet, D. A. Kolymagin, A. V. Pisarenko, A. G. Vitukhnovsky, S. A. Chesnokov. Imidazole-containing photoinitiators for fabrication of sub-micron structures by 3D two-photon polymerization. European Polymer Journal. 2021;145.
D. A. Chubich, D. A. Kolymagin, I. A. Kazakov, A. G. Vitukhnovsky. Morphology and Structural Parameters of Three-Dimensional Structures Created Using STED Nanolithography. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2018;82;1012–1017.
J. Fan, L. Qian. Quantum dot patterning by direct photolithography. Nat Nanotechnol. 2022;17: 906–907.
J. F. Galisteo-Lopez, M. Ibisate, R. Sapienza, L. S. Froufe-Perez, A. Blanco, C. Lopez. Self-assembled photonic structures. Adv Mater. 2011;23; 30–69.
G. N. Gol’tsman, O. Okunev, G. Chulkova, A. Lipatov, A. Semenov, K. Smirnov, B. Voronov, A. Dzardanov, C. Williams, R. Sobolewski. Picosecond superconducting single-photon optical detector. Applied Physics Letters. 2001;79; 705–707.
E. Gordon, A. Karabulin, V. Matyushenko, V. Sizov, I. Khodos. Stability and structure of nanowires grown from silver, copper and their alloys by laser ablation into superfluid helium. Phys Chem Chem Phys. 2014;16;25229–25233.
M. Grzelczak, J. Vermant, E. M. Furst, L. M. Liz-Marzan. Directed self-assembly of nanoparticles. ACS Nano. 2010;4:3591–3605.
D. Huo, M. J. Kim, Z. Lyu, Y. Shi, B. J. Wiley, Y. Xia. One-Dimensional Metal Nanostructures: From Colloidal Syntheses to Applications. Chem Rev. 2019;119;8972–9073.
A. Kaur, B. Bajaj, A. Kaushik, A. Saini, D. Sud. A review on template assisted synthesis of multi-functional metal oxide nanostructures: Status and prospects. Materials Science and Engineering: B. 2022;286.
E. P. Kozhina, S. N. Andreev, V. P. Tarakanov, S. A. Bedin, I. M. Doludenko, A. V. Naumov. Study of Local Fields of Dendrite Nanostructures in Hot Spots Formed on SERS-Active Substrates Produced via Template-Assisted Synthesis. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2021;84:1465–1468.
K. A. Magaryan, M. A. Mikhailov, K. R. Karimullin, I. A. Vasilieva, G. V. Klimusheva. Temperature dependence of the luminescence spectra of liquid crystal composites with CdSe quantum dots. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2014;78: 1336–1340.
O. M. Marago, P. H. Jones, P. G. Gucciardi, G. Volpe, A. C. Ferrari. Optical trapping and manipulation of nanostructures. Nat Nanotechnol. 2013;8; 807–819.
F. Porrati, S. Barth, G. C. Gazzadi, S. Frabboni, O. M. Volkov, D. Makarov, M. Huth. Site-Selective Chemical Vapor Deposition on Direct-Write 3D Nanoarchitectures. ACS Nano. 2023;17: 4704–4715.
C. Tan, J. Chen, X.-J. Wu, H. Zhang. Epitaxial growth of hybrid nanostructures. Nature Reviews Materials. 2018;3.
X. Wang, X. Dai, H. Wang, J. Wang, Q. Chen, F. Chen, Q. Yi, R. Tang, L. Gao, L. Ma, C. Wang, X. Wang, G. He, Y. Fei, Y. Guan, B. Zhang, Y. Dai, X. Tu, L. Zhang, L. Zhang, G. Zou. All-Water Etching-Free Electron Beam Lithography for On-Chip Nanomaterials. ACS Nano. 2023;17; 4933–4941.
R. Zvagelsky, D. Chubich, D. Kolymagin, A. Pisarenko, A. Vitukhnovsky. Fabrication of templates for metallic nanoantennas by STED-DLW lithography. 2019.
I. V. Semchenko, S. A. Khakhomov. Application of DNA molecules in nature- inspired technologies: a mini review. Frontiers in Nanotechnology. 2023;5.
R. V. Reshetnikov, A. V. Stolyarova, A. O. Zalevsky, D. Y. Panteleev, G. V. Pavlova, D. V. Klinov, A. V. Golovin, A. D. Protopopova. A coarse-grained model for DNA origami. Nucleic Acids Res. 2018;46; 1102–1112.
S. Ramakrishnan, B. Shen, M. A. Kostiainen, G. Grundmeier, A. Keller, V. Linko. Real-Time Observation of Superstructure-Dependent DNA Origami Digestion by DNase I Using High-Speed Atomic Force Microscopy. Chembiochem. 2019;20;2818–2823.
S. M. Douglas, H. Dietz, T. Liedl, B. Hogberg, F. Graf, W. M. Shih. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 2009;459; 414–418.
A. Rajendran, M. Endo, H. Sugiyama. Single-molecule analysis using DNA origami. Angew Chem Int Ed Engl. 2012;51; 874–890.
N. Li, Y. Shang, R. Xu, Q. Jiang, J. Liu, L. Wang, Z. Cheng, B. Ding. Precise Organization of Metal and Metal Oxide Nanoclusters into Arbitrary Patterns on DNA Origami. J Am Chem Soc. 2019;141: 17968–17972.
X. C. Bai, T. G. Martin, S. H. Scheres, H. Dietz. Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:20012–20017.
АВТОРЫ
Максим Евгеньевич Степанов – м. н. с., Московский педагогический государственный университет (МПГУ), каф. теор. физики им. Э. В. Шпольского, м. н. с. лаб. физики перспективных материалов и наноструктур, Москва, Россия.
РИНЦ ID: 334465
Scopus ID: 57195265809
ResearcherID: AAB‑6181-2022
ORCID: 0000-0002-0332-1235
Хохрякова Ульяна Александровна – бакалавр по направлению «Фундаментальная физика» МПГУ, лаборант-исследователь молодежной лаборатории биофотоники и наноинженерии.
Егорова Татьяна Владимировна – к. б. н., зав. молодежной лаб. биофотоники и наноинженерии, МПГУ, Москва, Россия.
Scopus ID: 56868341400
ORCID: 0000-0002-7554-5246
ResearcherID: P‑9982-2017
Магарян Константин Арутюнович – к. ф.‑ м. н., МПГУ, каф. теор. физики им. Э. В. Шпольского, с. н. с. лаб. физики перспективных материалов и наноструктур.
РИНЦ ID: 723988
ResearcherID: A‑4208-2014
ORCID: 0000-0003-4754-4657
Наумов Андрей Витальевич – член-корр. РАН, д.ф-м.н., Рук. Троицкого филиала ФИАН им. П. Н. Лебедева, зав. каф., МПГУ, член-корр. РАН, доц., Москва, Россия.
РИНЦ ID: 35867
Scopus ID: 7201349036,
ResearcherID: E‑8905-2010
ORCID: 0000-0001-7938-9802
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов. Все авторы приняли участие в написании статьи и дополнили рукопись в части своей работы.
ВКЛАД ЧЛЕНОВ
АВТОРСКОГО КОЛЛЕКТИВА
Статья подготовлена на основе работы всех членов авторского коллектива.
Отзывы читателей
